РАЗВИТИЕ ЭПИДЕРМИСА И ОРГАНОВ, В ОБРАЗОВАНИИ КОТОРЫХ ОН УЧАСТВУЕТ

Большая часть эктодермы, остающейся на поверхности зароды­ша после нейруляции, развивается в эпидермис кожи. Но мы уже знаем, что и различные другие структуры являются дери­ватами эктодермы. Она участвует в формировании глаза, так как из нее развиваются хрусталик и роговица. Большое число других органов и частей органов развиваются в связи с дифференциацией эпидермиса: перья, чешуи, потовые и сальные же­лезы, млечные железы у млекопитающих.

Эпидермис раннего эмбриона птиц и млекопитающих снача­ла состоит из одного слоя клеток. У куриного зародыша он, диф­ференцируясь взаимозависимо с подлежащей соединительной тканью, на 7-й день развития становится двухслойным. Лишь на поздних стадиях развития птиц и млекопитающих возникает внутренний листок, состоящий из ряда слоев размножающихся клеток, — так называемый мальпигиев слой эпидермиса. У ку­риного зародыша на 17-й день эпидермис становится многослой­ным. В теснейшей взаимозависимости дифференцируются эпите­лий и соединительно-тканная часть кожи — дерма. Вместе они и составляют кожу как орган. Соединительно-тканная часть кожи развивается из мезенхимы, являющейся производной мезодер-мального пласта зародыша (дерматом), и нервного гребня. Нерв­ный гребень в начале своего появления после смыкания нервной пластинки в медуллярную трубку представляет массу клеток, лежащих на месте бывшего смыкания краев медуллярной пла­стинки. Этот клеточный материал, мигрируя от места происхож­дения в латеральном и вентральном направлениях, у разных позвоночных участвует в образовании многих структур (жабр, частей лицевого скелета и т. д.). Висцеральный скелет, напри­мер, полностью развивается из клеточного материала нервного гребня.

У амфибий эпителий ранних эмбрионов двухслойный. Наруж­ный листок называется перидермой, а внутренний — сенсорным, потому что он принимает участие в образовании некоторых орга­нов чувств.

Начальные этапы развития многих структур — производных эпидермиса — сходны в том отношении, что сначала образуются локальные утолщения эпидермального эпителия. Эти пластинко-образные утолщения называются плакодами. В соответствующих местах возникают парные плакоды, производными которых явля­ются обонятельные мешки, черепные нервы, слуховые пузырьки и др. Из плакод, находящихся в соседстве со слуховыми, раз­виваются органы чувств боковой линии. У рыб боковая линия тянется вдоль всего тела, однако вся она образована плакодами, возникающими в области развития органа слуха.

Зачатком обонятельной выстилки органа обоняния служит пе­редняя, впоследствии обособляющаяся часть нервной пластинки.

Согласно данным Н. Джакобсона

 

(1966), индуцирующее влия­ние на эктодерму, подготовляющее детерминацию линзовой за­кладки, осуществляется не только глазным зачатком, но и энто­дермой, и презумптивной сердечной мезодермой.

Столь подробное изложение опытов, касающихся развития хрусталика, важно потому, что, как увидим в гл. XI, упоминав­шиеся интересные данные классических работ Г. Ш^емана и В. Льюиса послужили толчком для создания в 30-х годах Г. Шпеманом теории индивидуального развития, главенствовав­шей в эмбриологических исследованиях более двух десятилетий. Другие добавочные структуры глаза — сосудистая оболочка, склера, или, иначе, белочная оболочка, и роговица — обеспечи­вают его функцию.

Наружные оболочки глаза (сосудистая и склера) образуются из мезенхимы, окружающей развивающийся глазной бокал. Внут­ренний слой клеток мезенхимы развивается в сеть кровеносных сосудов, окружающих пигментный эпителий. Это и есть закладка сосудистой оболочки. Наружная масса мезенхимных клеток — источник формирования склеры — преобразуется в фиброзную капсулу, играющую защитную роль и служащую местом прикреп­ления мышц глаза.

У птиц и рептилий капсула становится хрящевой и даже кост­ной, у других позвоночных она остается фиброзной.

Сосудистая и белочная оболочки вначале прилегают друг к другу по всей поверхности глазного яблока. Впоследствии между ними, в передней части, возникает пространство — передняя ка­мера глаза. Склера становится в этом месте прозрачной и уча­ствует в образовании роговицы- (cornea). Соответствующий же участок сосудистой, оболочки идет на построение наружного со-единительне-тканного слоя радужной оболочки и покрывающей хрусталик зародыша сосудистой оболочки.

Как уже сказано, роговица развивается из эпидермального эпителия и мезенхимы. Эпителий и соединительная ткань буду­щей роговицы в ходе развития глаза становятся прозрачными. Покрывающий глаз эпителий пигментирован.

Многочисленными экспериментами Г. Шпемана (1901) и О. Мангольда (1931) доказано, что превращение участка кожи в роговицу зависит- от причинных» влияний, идущих от хруста­лика и всего глазного бокала. Если удалить глазное яблоко до образования роговицы, то она не развивается. Зависимость рого­вицы от всех остальных частей глаза сохраняется все время. Если удалить глаз у личинки амфибий или у взрослого живот­ного, то роговица вскоре теряет прозрачность и постепенно при­обретает структуру кожи.

У различных позвоночных неодинаковое строение различных добавочных структур глаза. У двухмесячного зародыша человека по верхнему и нижнему краям роговицы возникают две складки кожи. Это будущие верхнее и нижнее веки. На третьем месяце эти складки, разрастаясь, временно срастаются. Полость между веками и роговицей глаза называется конъюнктивальным меш­ком.

Если удалить зачаток глаза

 

(глазной пузырь или начинаю­щий формироваться глазной бокал) и предотвратить контакт глаз­ного пузыря с эпидермисом, то, как правило, линза не возникает. Эксперименты такого рода сами по себе еще не убеждают пол­ностью в «индукционной» способности глазного пузыря. Во-пер­вых, эти эксперименты грубые, так как резко нарушают нор­мальное состояние клеточных масс в зародыше. Во-вторых, дело осложняется тем, что не всегда достигается положительный ре­зультат в таких опытах. К тому же у некоторых амфибий (Rana esculenta, Xenopus laevis и др.) обнаружена некоторая степень «независимого» развития хрусталика, когда предварительно уда­лялся презумптивный материал глаза на стадии нейрулы. Раз­витие в этих случаях никогда не бывает нормальным, но нередко формируются довольно типичные линзы с соответствующими ци-топлазматическими преобразованиями клеток в волокнистые структуры. Однако эти вселяющие сомнение факты требуют осо­бого анализа и не опровергают основных данных о влиянии глазного пузыря на эпидермис, из которого возникает хрусталик.

Демонстративные результаты дают опыты, в которых уда­лялся презумптивный эпидермис линзы и на его место переса­живался эпидермис, взятый с какой-либо другой части зародыша, например с головы или брюха. Эпидермис побуждался в этих опытах к развитию линзы.

Наконец, убедителен и третий тип экспериментов. Если вы­резать глазной пузырь и трансплантировать его под эпидермис в другой части тела зародыша, то иногда эпидермис развивает­ся в линзу.

Считается, что для индукции хрусталика необходим непосред­ственный контакт эпидермиса с глазным пузырем: Мэк Кийен в 1951 г. показал, что помещение между глазным пузырем и эпи­дермисом тонкого листочка целлофана (в опытах на курином зародыше) предотвращает индукционное действие глазного пу­зыря. Однако тот же исследователь в опытах 1958 г. (также на курином зародыше) доказал, что частичное экранирование эпи­дермиса от глазного пузыря тонкой полоской агара не предот­вращает полноценного развития хрусталика. Если индуцирующий агент химической природы, то он должен был в этих опытах или проходить через агар, или обойти вокруг него.

Химическая природа индуцирующего действия глазного пузы­ря пока неясна. Есть предположения, отчасти подтверждаемые экспериментами, что когда глазной пузырь приходит в контакт с эпидермисом, он содержит большое количество, РНК, а пре-зумптивный хрусталиковыи эпидермис имеет мало нуклеиновых кислот. После контакта глазного пузыря с эпидермисом появ­ляется большое количество РНК и в эпидермисе. Может быть, молекулы нуклеиновых кислот проходят от клеток глазного пу­зыря в клетки презумптивной линзы. Однако если бы это и ока­залось так (что не удается пока доказать), нелегко дать хими­ческую интерпретацию индукционной роли глазного пузыря в образовании линзы.

Некоторые исследователи (например, Б. И. Балинский, 1961) предполагают, что индукционное воздействие на презумптивный линзовый эпителий исходит не только из глазного пузыря, но и из головной мезодермы, и делают попытку объяснить причины обнаруженных многими авторами отклонений в результатах опы­тов по индукции хрусталика глазным бокалом.

У амфибий и костистых рыб только внутренний листок

 

эпи­дермиса принимает участие в утолщении; это утолщение отде­ляется от эпидермиса в виде очень плотной массы клеток, ко­торые, перегруппировываясь, образуют хрусталик. При любом типе формирования хрусталиков в них происходят сложные ци­тологические преобразования. Клетки внутренней стороны пу­зырька будущей линзы удлиняются.и постепенно преобразуются в длинные волокна. Ядра клеток дегенерируют, цитоплазма де­лается плотной и прозрачной. Волокна располагаются не беспо­рядочно, а в строго закономерном направлении; при этом и формируется сферическое, или эллипсоидное, преломляющее свет тело линзы. Но часть линзового эпителия таким образом не из­меняется и покрывает измененную часть. Возникает точка роста линзы — место соединения неизменного эпителия с массой волокон линзы. Это, фигурально выражаясь, мастерская линзооб-разования. В этом месте эпителиальные клетки непрерывно пре­вращаются в волокна, линза растет.

На примере развития глаза экспериментальные эмбриологи еще в начале нашего столетия убедились, что в ходе органогене­за происходит взаимозависимость развивающихся клеток, тка­ней, частей органов. Эта взаимозависимость, однако, такого рода, что тем или иным клеточным и тканевым компонентам принад­лежит «ведущая» роль. Они, образно говоря, индуцируют раз­витие соседнего клеточного материала (см. гл. XI). Этот факт, имеющий большое принципиальное значение, был установлен Г. Шпеманом и В. Льюисом еще в 1901 г. В. 1904 г. было обна­ружено, что между развитием глазной чаши и развитием линзы существует тесная связь: глазной пузырь индуцирует развитие из прилежащего к нему эктодермального эпителия хрусталика. От глазной чаши, вершина которой контактирует с эпидермисом, как бы исходит какое-то «организующее» влияние — стимул пре­образования клеток эпидермиса в хрусталик. Огромным количе­ством экспериментов большого числа исследователей, в частно­сти советских ученых, было доказано, что любые эпидерм альные клетки при определенных условиях побуждаются к формирова­нию линзы или линзоподобных образований. Доказательства пра­вильности этого положения получены разными эксперименталь­ными способами

Сначала очень широкое отверстие глаза

 

постепенно сильно сужается, но так, что это сужение происходит неодинаково по всей окружности. На вентральном крае глазного бокала отвер­стие остается более открытым. Здесь образуется желобок, дости­гающий глазного стебелька (fissura chrioidea). По желобку в заднюю камеру глаза входят кровеносные сосуды и мезенхим-ные клетки, которые затем и окажутся в стекловидном теле. Впоследствии края сосудистой щели зарастают. У человеческого зародыша это происходит уже на седьмой неделе.

Задняя (большая) часть внутреннего слоя бокала дифференцируется в зрительную часть сетчатки (pars optica retinae), а пе­редняя (меньшая) часть — в радужную и ресничную части. Рес­ничная часть оболочки вместе с прилегающей в этом месте пиг­ментной оболочкой образует концентрические складки, в которые врастает клеточный материал мезодермального происхождения. Так возникает ресничное тело (corpus ciliaris), в котором раз­виваются ресничные мышцы. К ресничному телу с помощью во­локонец— ресничной круговой пленки—прикрепляется хруста­лик. Из радужной части сетчатки при участии сигментной и сосу­дистой оболочек возникает радужная оболочка (iris). Клеточные элементы сетчатки дифференцируются и в нервные волокна, из которых развивается зрительный нерв; он заполняет просвет глаз­ного стебелька. Из клеточного материала мезодермального про­исхождения, врастающего в сосудистую щель глазного стебелька, развиваются кровеносные сосуды, питающие сетчатку.

Глазной бокал не составляет еще глаза. Для нормальной функ­ции зрения должны развиваться добавочные важные структуры. Это прежде всего хрусталик (линза), благодаря которому вхо­дящие в глаз лучи света преломляются. Линза развивается из эктодермального эпителия, который в месте контакта с эктодер­мой наружного участка глазного пузыря утолщается, а клеточ­ные элементы претерпевают специфическую дифференцировку, они становятся призматическими и превращаются впоследствии в хру-сталиковые волокна. Клеточная масса будущего хрусталика от-шнуровывается, превращаясь постепенно по своей структуре и физическим свойствам в хрусталик.

У разных групп позвоночных развитие хрусталика и отде­ление его от эпидермиса варьирует. У птиц и млекопитающих возникают утолщения всего эпидермального слоя (в месте кон­такта с глазным пузырем). Из складывающихся утолщений обра­зуются на короткое время открытые кнаружи карманы; эти утол­щения впоследствии и превращаются в пузырек — формирующую­ся линзу.

РАЗВИТИЕ ГЛАЗА

Развитию органа зрения позвоночных посвящено необозримое ко­личество работ. Глаза амфибий — излюбленный объект в экспе­риментальной эмбриологии. В СССР многочисленные исследова ния проведены Д. П. Филатовым, В. В. Поповым, Т. В. Лопа-шовым, В. А. Голиченковым, Д. В. Поповым,  Г. Г. Квинихидзе и др. Если миновать детали развития этого сложного органа и почти не касаться гистогенетических процессов, изучаемых обыч­но в гистологии, развитие глаза представляется в следующем виде.

Как уже было сказано, первоначальные закладки глаз воз­никают в виде глазных пузырей — выпячиваний стенок промежу­точного мозга (рис. 77,5). Размер глазных пузырей относительно остальной части prosencephalon у разных позвоночных сильно варьирует. Так, по данным Б. И. Балинского (1958), у различ­ных видов лягушек глазные пузыри составляют от 10 до 50 % всего переднего мозга (включая и промежуточный). У костистых рыб, рептилий и птиц возникают зачатки глаз значительно боль­шего размера по сравнению с глазными пузырями амфибий. У зародышей млекопитающих они небольшие. По мере развития глазные пузыри все более обособляются от мозга и остаются соединенными с ним тонкими глазными стебельками.

Увеличиваясь, глазной пузырь приходит в непосредственный контакт с эктодермой и одновременно в нем начинают происхо­дить сложные морфологические изменения. Наружная поверх­ность глазного пузыря уплощается, а затем инвагирует внутрь, так что глазной пузырь превращается в конце концов в двух­слойную чашу — глазной бокал. Инвагинированная стенка бокала значительно толще, чем наружная. Внутренний слой клеток глаз­ного бокала — это закладка сетчатки (retina), наружный слой — закладка пигментной оболочки (stratum pigmenti или tapetum nigrum). Край глазной чаши впоследствии превращается в край зрачка. Полость глазной чаши — это будущая задняя камера глаза, заполняющаяся стекловидным телом, которое развивается из внутреннего листка глазного бокала, т. е. оно эктодермального происхождения. Однако в формировании стекловидного тела при­нимают участие и клеточные элементы мезодермального проис­хождения, врастающие через сосудистую щель.

РАЗВИТИЕ СПИННОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Спинной мозг развивается так, что клетки его стенок, размно­жаясь, дифференцируются в двух направлениях—одни в ней-роглию (поддерживающие клетки), а другие —в нервные. Под­держивающие клетки, располагающиеся вокруг нервного канала и в толще боковых стенок, образуют отростки, которые как бы поддерживают, скрепляют нервные клетки. Клеточные тела нейробластов образуют серое вещество спинного мозга, а нерв­ные волокна и их миелиновые оболочки — белове-вещество.

Часть отростков выходит из спинного мозга. Это — брюшные корешки спинно-мозговых нервов. Вследствие разрастания брюш­ных и спинных частей серого вещества возникают передние и задние рога спинного мозга. В связи с развитием конечностей вместе с отхождением нервов конечностей в спинном мозге раз­виваются шейное и поясничное утолщения. В книге даются лишь общие сведения о развитии периферической нервной системы. Двигательные нервные волокна нервной трубки выходят сег-ментно расположенными пучками и дают начало двигательным корешкам спинно-мозговых нервов. Позднее после образования ганглиозной пластинки дифференцируются в сегментные спинно­мозговые узлы с двумя отростками: одни отростки растут по направлению к спинному мозгу и прорастают в него — это бу­дущие чувствительные корешки спинно-мозговых нервов, другие отростки растут в брюшном направлении и соединяются с во­локнами двигательных корешков в спинно-мозговые нервы. Эти смешанные нервы отделяют от себя задние ветви, которые иннер-вируют спинную мускулатуру двигательными волокнами и кожу спины — чувствительными волокнами. Затем спинно-мозговые нервы продолжаются в виде передних ветвей, иннервирующих брюшную мускулатуру (двигательные нервы) и кожу (чувстви­тельные нервы).

От передних ветвей вырастают висцеральные ветви (с дви­гательными и чувствительными волокнами). Власледствии в кон­цевых частях этих ветвей из нервных клеток закладываются по обеим сторонам нисходящей аорты два ствола симпатической нервной системы.

Развивающиеся головные нервы при описании можно объеди­нить в три группы: 1) чувствующие нервы, из которых упомянем обонятельный, слуховой и глазную ветвь тройничного нерва; 2) двигательные нервы — это нервы глазодвигательных мышц и подъязычный; 3) смешанные нервы, формирующиеся из двига­тельных волокон головного мозга и чувствительных нервных во­локон, так называемых головных узлов, возникающих за счет ганглиозных валиков, образующихся впереди заднего мозгового пузыря. К этой группе нервов относится тройничный и лицевой, языкоглоточный и блуждающий.

Дорсальная часть

нервной трубки вытягивается сильнее, чем вентральная вследствие чего задний конец труб­ки выносится за бластопор. Затем происходит изгибание трубки на некотором расстоянии от бластопора. Вершина образующегося изгиба становится зачатком хвоста (рис. 76). Участок, лежащий между вершиной зачатка хвоста и бластопором, дифференцирует­ся как мышцы хвостовой области.

У разных животных, в зависимости от степени сложности нерв­ной системы, имеются значительные анатомические и гистологиче­ские особенности, а также особенности в топографии различных участков центральной нервной системы позвоночных.

У низших позвоночных, например у акуловых рыб, форма дефинитивного мозга мало отличается от мозга их зародышей. У высших позвоночных, в особенности у человека, развивающийся мозг ранних зародышей по своей морфологии мало отличается от мозга взрослых рыб или амфибий, но дефинитивный мозг, особенно по клеточной и тканевой структуре, резко отличается от мозга низших представителей позвоночных. Прогрессивная эволюция организмов не обязательно сопровождалась усложне­нием в устройстве всех органов. Так, в некотором отношении глаза у птиц или некоторых насекомых более совершенны, чем глаза млекопитающих. Что касается эволюции головного мозга, то у человека он достиг поразительного совершенства, и, грубо говоря, бывший и дальнейший большой прогресс в его струк­туре и функциях не коррелирован со сравнительно медленными и менее радикальными преобразованиями других органов, напри­мер кишечного тракта.

НЕЙРУЛЯЦИЯ. РАЗВИТИЕ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Следующая за гаструляцией стадия в развитии позвоночных — нейруляция. Зародыш на этой стадии называют нейрулой. Мате­риал презумптивной нервной системы у позвоночных животных — это обширный пласт клеток, покрывающий хорду и сомиты. По краям нервной пластинки образуются два нервных, или медул­лярных, валика — утолщения пластов клеток презумптивной нервной системы . Эти утолщения возникают сначала на переднем конце зародыша, а затем постепенно появляются в средней или задней частях его. Впоследствии валики становятся все более высокими, сближаются сначала в срединной части, а затем и в задней; наконец, смыкаются своими гребнями, образуя нервную, или медуллярную, трубку. Эта трубка, развивающаяся в спинной мозг, приблизительно одинакового диаметра на всем протяжении. Передний отдел нервной трубки образуется позд­нее, также путем смыкания валиков, которые, однако, здесь бо­лее высокие, поэтому головной отдел медуллярной трубки ока­зывается более расширенным. Из него развиваются передний и средний мозговые пузыри. В передней части нервной трубки полость ее шире, чем в задней. .

Позднее головной отдел| медуллярной трубки превра­щается в головной мозг. По­лость задней части нервной трубки превращается в канал спинного мозга.

Важно отметить, что часть клеток не включается ни в нервную трубку, ни в эпидермис. Они распо­ложены в виде полоски по всей длине нервной трубки. Образуется нервный гребень, или ганглиозная пластинка. После того как нерв­ная трубка отделяется от эпидермиса, эта полоска располагается между нервной трубкой и покрывающим ее эпителием, но впо­следствии она разделяется на правую и левую половины, которые залегают дорсолатерально по отношению к нервной трубке. Пе­редний участок презумптивного головного мозга довольно долго не закрывается. Отверстие на переднем конце нервной трубки называется нейропором (или невропором). Задний отдел нервной пластинки при замыкании в трубку прикрывает своим сводом бластопор. Он находится теперь на заднем конце дна медулляр­ной трубки и становится нервно-кишечным каналом. (У некото­рых позвоночных, в частности у хвостатых амфибий, нервно-ки­шечный канал не возникает.) В области шеи и туловища нервная трубка дифференцируется в спинной мозг, а передняя часть нервной трубки превращается в головной мозг. Передний уча­сток нервной пластинки у всех позвоночных и в особенности у человека значительно шире, и с самого начала формирования нервной трубки диаметр ее неодинаков в разных участках. Зна­чительно более расширен передний, головной участок, и стенки трубки здесь толще, чем в задней части. Дорсальный и вен­тральный участки стенки медуллярной трубки более тонкие, чем разрастающиеся боковые участки. Канал нервной трубки пре­вращается в центральный спинно-мозговой канал развившегося мозга.

КЛАССИФИКАЦИЯ ОРГАНОВ КАК ПРОИЗВОДНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ ПЛАСТОВ

Органогенез — предмет исследования эмбриологии, гистологии, анатомии, физиологии и других наук, так как он является сово­купностью процессов изменения формы, тканевого строения, воз­никновения и изменения биохимических и физиологических яв­лений и т. д. Эмбриология должна изучать процессы, сопровож­дающие развитие того или иного органа в их совокупности и при разных способах репродукции. Однако это пока идеал, к ко­торому стремятся. На самом деле развитие органов изучается в разных аспектах и подчас очень односторонне, в отрыве морфо­логии от физиологии. Невозможно сообщить в книге необозримое количество данных о развитии всех органов животных. В даль­нейшем будут даны только отдельные примеры. Выбор их не произволен: он диктуется или особой важностью этих органов для жизни организмов, или возможностью на развитии данного органа познакомиться с общими закономерностями формообра­зования, вскрытыми эмбриологией, или, наконец, большей изу­ченностью развития некоторых органов излюбленных эмбриоло­гами объектов. К сожалению, состояние эмбриологии не позво­ляет дать какой бы то ни было сравнительный очерк органогенеза •беспозвоночных и позвоночных животных. Потребности меди­цины и ветеринарии обусловили большее внимание к органоге­незу позвоночных и особенно млекопитающих. Вот почему в книге дается описание органогенеза именно позвоночных животных. При изучении органогенеза надо учесть, что классификация органов по их генезису (производные эктодермы, энтодермы и мезодермы) вполне оправдана эмбриологическими данными и теорией зародышевых пластов в том смысле, что возникновение зачатка (закладки) органа связано с локальными изменениями определенных участков того или иного зародышевого пласта. Однако в большинстве случаев органы позвоночных — производ-•ные двух или всех трех зародышевых пластов (например, яичник, кишечная трубка, орган слуха, нос и т. д.), при этом подчас невозможно выделить какой-либо главенствующий клеточный ма­териал, от которого зависел бы механизм развития органа. По­этому классификация органов на эктодерм альные, энтодерм аль-ные и мезодермальные столь же доступна сомнениям, критике, ограничениям, как и теория зародышевых пластов, на которой эта классификация основана.

Нельзя придавать этой классификации тот смысл, будто кле­точный материал первоначальной закладки органа приобретает какие-то особые гистотипические и «органные» свойства. Это неверно, во-первых, потому, что развитие органа, по крайней мере вначале, не есть автономный процесс, оно происходит при тесней­шем взаимодействии составляющих зачаток клеток и взаимодей­ствии различных зачатков. Во-вторых, при бесполом" размноже­нии и экспериментальном соматическом эмбриогенезе развитие органов той же структуры и с теми же функциями может про­исходить существенно по-иному, в результате иных гистогенети-ческих, анатомических и физиологических процессов.

процессы деления клеток

 

Продполагают, что некото­рые из этих веществ, вырабатываясь уже на ранних стадиях раз­вития, играют роль своеобразных внутриклеточных гормонов, регулирующих процессы деления клеток; затем они приобретаюг функции гормонов, играющих роль в движении клеток, и, наконец, становятся медиаторами нервной системы. Удалось обнаружить. синтез медиаторов на очень ранних стадиях развития. Так, яйце­клетки вьюна синтезируют серотонин уже на 12 мин после опло­дотворения. Синтез ацетилхолина, серотонина и адреналина обна­ружен в яйцеклетках морских ежей, он резко усиливается сразу после оплодотворения, за 1,5—4 ч до первого клеточного деления, и значит, за 10—15 сут до начала формирования нервной системы. (Г. А. Бузников, 1968). Предполагают, что «до нервный» синтез медиаторов — универсальное явление. Эти вещества играют важ­ную роль в регуляции процессов деления клеток.

К изложенным представлениям о значении физических явле­ний и амебоидного движения в морфогенетических процессах Т. Густафсон в 1966—1969 гг. внес существенно новое, именно-в связи с представлениями о медиаторах. Изучая влияние на про­цессы развития морского ежа многих фармакологических веществ, блокирующих нервногуморальную трансмиссию (1968), он обна­ружил функционирование примитивного нейросекреторного меха­низма, в котором большая роль принадлежит серотонину. Благо­даря псевдоподиальной активности на стадии гаструляции из вершины архентерона, а позже из эктодермальных ресничных шнуров мигрируют клетки, которые можно назвать «первичными нейронами»; в них локализованы медиаторы нервной системы. Эти клетки играют роль в нервной трансмиссии и стимулируют морфогенетическое движение, активируя группы эктодермальных клеток. Густафсон предположил, что серотонин служит веществом, обеспечивающим гаструляционные передвижения клеточных плас­тов. Серотонин нейтрализует влияние различных веществ, способ­ных остановить гаструляцию.

Исследования влияния нейрофармакологических веществ не­сомненно интересны.

Почему в результате дробления формируется

 

не компактная масса клеток, а полый шар (бластула)? По Густафсону, это под­дается объяснению в терминах механики и геометрии. Примем во* внимание радиальный план дробления яйца ежа, а также то, что-клетки очень сильно прилипают к гиалиновой мембране, имеющей­ся на наружной поверхности бластулы. Гиалиновый слой (мембрана) достаточно хорошо-изучен. Он может быть отделен'от клеток. Этот слой необходим для развития; гаструляция у морских ежей может блокироваться, если. нарушить целостность гиалинового слоя.

Как видно из схемы, внешний и внутренний объемы бластулы по мере делений клеток по геометрическим причинам должны возра­стать.

Дальнейшие изменения формы, все более локальные, не зави­сят от делений клеток. Например, ко времени инвагинации проис­ходят различные утолщения стенки и ее кривизны. Сферическая^. форма преобразуется так, что становится треугольной. Если кон­такт между клетками будет возрастать, а контакт их с мембра­ной останется константным, то слой клеток будет неизбежно ис­кривляться. Если контакт с мембраной уменьшается, то образу­ется слой столбчатых клеток.

Однако вскоре в развитии зародыша вступают в силу новые-факторы не меньшего значения. Это — «псевдоподиальная актив­ность» клеток, возможность активных перемещений клеток. На стадии поздней бластулы происходит миграция первичных мезен­химных клеток в бластоцель . В области вегетатив» ного полюса связь между клетками и с гиалиновой мембраной-ослабляется, клетки приобретают амебоидную подвижность и про­тискиваются в бластоцель. Это сопровождается энергичными пуль­сациями клеток на их внутренней поверхности (естественно, что на внешней стороне, где они связаны с мембраной, пульсаторные движения исключены). Псевдоподиальная активность первичных мезенхимных клеток усиливается, энергично образуются длинные псевдоподии, которые как бы «выстреливаются» клетками в блас­тоцель . Концы псевдоподий контактируют со стенкой бластулы. Сокращение псевдоподий вызывает «подтягивание», переме­щение клеток. Если же не произошло контакта концов псевдоподий со стенками, то они втяги­ваются в клетку. Клетки рассеиваются в нижней половине бластулы. Т. Гу-стафсон делает предполо­жения об особенностях со­стояния разных участков стенки бластулы, о свое­образии контактов меж­ду клетками и в связи с этим о неодинаковых возможностях слипания концов псевдоподий с разными, клетка­ми. Для понимания образования первичной мезенхимы оказыва­ются ненужными старые представления о хемотаксисе клеток.

Густафсон дает объяснение и процессам инвагинации и обра­зования вторичной мезенхимы. При первой фазе инвагинации от­мечается энергичное «кипение», и «вспузыривание» клеток, подоб­ное тому, что обнаружено и для клеток первичной мезенхимы. Это опять-таки связано с ослаблением контактов между клетками, но связь с гиалиновой мембраной при этом остается. По чисто меха­ническим и геометрическим причинам должна происходить инваги­нация. Если концы пласта фиксированы, клетки имеют тенденцию к округлению и контакт их друг с другом уменьшается, то слой должен изменяться так, как это и происходит в начале инва­гинации. Продвижению пласта способствует «выстреливание» псевдоподий клетками вершины инвагинирующей области. Концы псевдоподий слипаются с клетками эктодермы, и это содействует «подтягиванию» первичной кишки. Клетки на вершине конуса, наконец, теряют связь между собой и с гиалиновой мембраной и внедряются в бластоцель, образуя вторичную мезенхиму. Есть указания на то,- что вещества, связанные с функционированием нервной системы, играют важную роль в морфогенетических про­цессах уже на ранних стадиях развития организмов. Утверждают, что синтез медиаторов нервной системы происходит уже на ран­них стадиях развития зародышей, задолго до возникновения нерв­ной-системы. Медиаторы нервной системы —это низкомолекуляр­ные физиологически активные вещества — ацетилхолин, серотонин, адреналин и др., — благодаря которым осуществляется передача нервных влияний от клетки к клетке.

ГИПОТЕЗА Т. ГУСТАФСОНА

 

Работы Т. Густафсона и его коллег могут служить примером пло­дотворных поисков связи между биохимией и морфологией раз­вития. Густафсон справедливо утверждает, что в эмбриологии

почти нет гипотез и фактических данных о причинных зависимос­тях между биохимическими изменениями (например, в синтезе -нуклеиновых кислот и белков), с одной стороны, и морфологичес­кими изменениями — с другой. Необходимо искать «мосты». В фи­зиологии стандартной практикой является объяснение процессов в терминах физических наук, например объяснение биения сердца и циркуляции крови на основе гидродинамики. В эмбриологии также требуется изучение электрических, гидростатических и иных внутриклеточных и межклеточных сил. Это поможет найти недо­стающие звенья связи между химическими и морфологическими -процессами.

Густафсон пытался объяснить морфологию развития морского •ежа, в частности процессов гаструляции, с использованием в ос­новном двух групп закономерно наблюдаемых явлений: по-первых, степени слипания, степени контактов между клетками и, во-вто­рых, амебоидной подвижности клеток.

Используя метод цейтраферной микрокиносъемки, он изучил такие явления, которые не были известны эмбриологии. В зре­лом, еще не дробящемся яйце имеются три зоны с определенным значением: клетки анимального полушария — это бу­дущая эктодерма (3-я зона): клетки вегетативного полушария — это клетки первичной мезенхимы (1-я зона) и, наконец, клетки, находящиеся между названными зонами, — это энтомезодерма (2-я зона). За первые 10 ч (приблизительно после десятого дроб­ления) образуется сферическая однослойная бластула, состоящая лримерно из 1000 клеток.

В эмбриологической литературе не раз

 

дискутировался воп­рос — являются ли морфогенетические движения, наблюдаемые в ходе гаструляции, функцией зародыша в целом или к моменту перехода от бластулы к гаструле происходит уже такая дифферен-цировка частей зародыша, что эти части способны к автомати­ческим, не зависящим от целого преобразованиям. Однако столь резкое противопоставление целого его частядо и соответственно противопоставление предполагаемых двух групп факторов может быть несколько метафизично и заслуживает внимания лишь в по­рядке рабочей гипотезы, дающей возможность экспериментиро­вать для получения ориентировочных данных.

Эксперименты в таком направлении оказались очень полезны­ми, так как результаты их хотя и не объясняют процессы гастру­ляции, но ставят ряд новых неожиданных проблем, что уже зна­менует прогресс знаний. Если поместить зародыши амфибий в подщелоченную воду (рН 9,6 или 9,8), то они распадаются на не связанные между собой клетки. Масса диссоциированных таким образом клеток приготовлялась из эктодермы, энтодермы и мезо­дермы со стадии гаструлы, из эпидермиса и нервной пластинки со стадии нейрулы и т. п. Массы клеток смешивались в различ­ных комбинациях и помещались в растворы с нормальным для них рН (8,0). Клетки начинали соединяться в агрегаты соответственно их свойствам (рис. 68). Эктодермальные клетки и клетки нервной пластинки со стадии нейрулы оказывались на поверхности комоч­ков, а мезодерм альные клетки и клетки энтодермы, находивши­еся в общей массе с клетками эпидермиса, имели явную тенден­цию расположиться внутри комочков. При комбинации диссоции­рованных клеток всех трех зародышевых пластов эктодерм альные клетки концентрировались на поверхности и мезодермальные клетки оказывались между эктодермальными и энтодермальными клетками.

Эти и подобные им факты следует взять на учет при анализе процессов гаструляции. П. П. Иванов и другие исследователи обращали внимание на то, что на стадии поздней бластулы ам­фибий клетки в разных частях зародыша неодинаковы по своим физиологическим потребностям: эктодермальные клетки «требу­ют» „одних условий, а клетки, омываемые внутренней средой—• жидкостью бластоцеля, проявляют свою физиологическую актив­ность при иной среде.

Каковы бы ни были физико-химические особенности- клеток, побуждающие их к определенным типам взаимосвязи (будь то особенности клеточных мембран, своеобразие слипания клеток или иммунохимические свойства типа антиген — антитело), эти особенности несомненно играют роль в морфогенетических движе­ниях клеток и клеточных масс. В дальнейшем эти вопросы будут дополнительно рассмотрены в гл. XV.

Поведение клеточных элементов и частей эмбриона не авто­номно: 1) намечающаяся клеточная дифференцировка в разных частях зародыша есть результат развития зародыша в целом; 2) в дальнейшем развитии поведение зародышевых пластов и разных участков зародыша, как увидим в гл. XI, определяется не только приобретенными морфогенетическими потенциями частей, но и взаимным влиянием частей. К тому же не следует переоценивать результаты указанных опытов, так как в лучшем случае их ре­зультаты лишь отдаленно напоминают действительные процессы нормального развития — формирование соответствующих пластов клеток, полостей и т. д. В гл. XI о детерминации будут сообщены многие факты якобы независимого развития частей зародыша в условиях эксплантации и дан анализ этих фактов.

Одной из биологических особенностей клеток

 

является их способность к амебоидным движениям и фагоцитозу. Эти две черты — отражение древнейших свойств клеточных существ. Б. П. Токин в 1955 г. в связи с проблемой иммунитета зародышей предполагал, что следует придавать значение важному обстоя­тельству: потенциально всем жизнедеятельным клеткам любых тканей, принадлежащих организмам любой степени сложности, свойственны фагоцитарная способность и амебоидная подвиж­ность (см. гл. XV). Эта способность находится под «арестом» ин­теграции тканей благодаря взаимным влияниям клеток и, веро­ятно, еще неизвестным факторам биологической и физико-хими­ческой природы. Взаимное влияние клеток имеется уже на са­мых ранних стадиях развития зародыша в эпителиального типа пластах, как и в любом скоплении клеток. В случае нарушения состояния интеграции и освобождения их от обычных корреляций клетки начинают проявлять способность к амебоидному движению и к фагоцитарным реакциям.

Впервые Гольтфретером показано, что если зародыши амфибий на стадии бластулы, гаструлы или нейрулы дезинтегрировать (до­биться химическими способами диссоциации зародыша на отдельные клетки и группы их), то проявляется фагоцитарная актив­ность одиночных клеток.

Таким образом, способность клеток зародыша к амебоидной подвижности является прочно установленным экспериментами фактом. Это помогает объяснять поведение одиночных клеток и их групп, наблюдаемое в ходе гаструляции, происходящей по типу униполярной и мультиполярной иммиграции. Одним из моментов морфогенетических движений при гаструляции у морского ежа яв­ляется активное перемещение клеток внутрь бластоцеля. Несом­ненно, и при смешанных типах гаструляции, например у амфибий, способность к амебоидным движениям клеток играет важную роль. Несколько искусственно сближать явления фагоцитоза с про­цессами обволакивания анимальными бластомерами вегетатив­ных, наблюдающихся при гаструляции, которая происходит по типу эпиболии, хотя не исключена возможность того, что эти процессы имеют общую морфофизиологическую основу в жизни клеток.

электронно-микроскопические снимки заро­дышей амфибий

Эти мысли очень подкупают своей ясностью. Однако Б. Балин-ский в 1961 г., изучая электронно-микроскопические снимки заро­дышей амфибий, не обнаружил ни coat, ни вообще каких-либо мембран, помимо известных оболочек яйца амфибий. Грустно от­казываться от оригинальной гипотезы Гольтфретера. Может быть, в этом нет надобности, так как и Балинский утверждает, что ди­стальные концы клеток очень прочно соединены между собой бла­годаря каким-то «цементирующим» субстанциям, являющимся экскрецией самих клеток. Координирующим механизмом морфо-генетических движении могут быть, вероятно, и другие клеточные структуры, например нитевидные отростки клеток. Таким обра­зом, их поведение в районе дорсальной губы бластопора можно объяснить исходя из предположений Гольтфретера, но заменив слишком прямолинейные представления о coat как пленке и о ме­ханизме движения более физиологической теорией.

Для анализа процессов гаструляции, как и других морфо-генетических движений клеток и клеточных масс, следует все больше привлекать многочисленные цитологические данные о раз­ных типах связей между клетками, обнаруживаемых химически­ми и электронно-микроскопическими исследованиями. Одним из инициаторов изучения взаимодействия между клетками является английский исследователь М. Эберкромби, а также Дж. Картис.

Характер сцепления между клетками, разная степень слипа­ния, структура межклеточных пространств и другие факторы игра­ют, по-видимому, огромную роль во всех явлениях формообразо­вания, в том числе и в процессах гаструляции. Связи между клетками могут быть разнообразными: выросты мембран клеток, выпускание псевдоподий, ундулирующие мембраны (пластинча­тые выросты, способные волнообразно колебаться) и т. п.

Между клетками даже таких плотных тканей, как эпителии, никогда не бывает полного контакта, всегда существует между их мембранами пространство (60 нм и более). Большие простран­ства между клетками (до долей мк) наблюдаются в мезенхим-ных тканях. Пространства между клетками — не пустота, они за­полнены веществами — продуктами жизнедеятельности клеток. Старые представления о клетках как стабильных кирпичиках и тканях как стабильных сооружениях из иих следует целиком оставить. Клетки могут скользить своими поверхностями, они никогда не бывают в покое, если они живы, и стабильность сооружений — тканей и органов — объясняется не тем, что клетки находятся в мертвом, неподвижном состоянии, а иными надкле-точными закономерностями. В этом отношении возможна анало­гия архитектоники живых существ с физическим состоянием твер­дых тел, «твердость» которых отнюдь не объясняется неподвиж­ностью молекул. Последние находятся всегда в движении. Но архитектоника пластов клеток может сильно меняться при нор­мальных процессах формообразования, и клетки, освобожденные из общих связей, могут проявлять скрытые до того потенции.

ПРАВИЛА О. ГЕРТВИГА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

К АНАЛИЗУ РАЗВИТИЯ АМФИБИЙ, РЫБ, ПТИЦ И НАСЕКОМЫХ

Уже упоминалось о большом значении, которое придает эмбрио­логия правилам О. Гертвига для понимания причин разных типов дробления яиц.

Первое правило Гертвига: ядро занимает центр активной протоплазмы (полностью или почти полностью свободной от желтка). В алецитальных и изолецитальных яйцах ядро располо­жено ближе к центру а у телолецитальных оно рас­полагается эксцентрично, в анимальном полушарии.

Второе правило Гертвига: веретено деления ядра располага­ется в направлении наибольшей протяженности чистой протоплаз­мы

Ярким примером правильности этих утверждений служит характер дробления телолецитальных яиц амфибий. Ядро у них, как уже сказано, расположено в анимальном полушарии. Наи­большая протяженность чистой протоплазмы параллельно эквато­риальной плоскости . В этом направлении и окажется веретено первого деления ядра. Кариокинетический процесс связан с передвижением различных составных частей клетки, ее хромосом, частей цитоплазмы, корти­кального слоя. Классическая описатель­ная гистология и цитология, так много давшие биологии с - их методиками фиксации и окрашивания клеток, при­вивают, однако, изучающему клетки, тка­ни и развитие организма совершенно не соответствующее действительности представление о клетках, как о чем-то неподвижном. Мы неоднократно будем убеждаться в том, что такое представле­ние о клетках необоснованно.

Различного рода закономерным дви­жениям составных частей ядра и цитоплазмы могут мешать зерна и пластинки желтка. Если желток. расположен очень компактно, то процесс дробления в определен­ном участке яйца может подавляться.

Первая борозда дробления у яиц амфибий определяется ука­занным направлением веретена деления ядра (параллельно эква­ториальной плоскости, иначе — перпендикулярно к анимально-вегетативной оси яйца). Поэтому дробление произойдет в плоскости одного из меридианов яйца

Близкие к этому представлению мысли высказал

 

в 1941 г. А. Р. Мур в связи с анализом формы клеток при нейруляции

  Предполагают, что неодинаковая интенсивность поглощения воды различными клетками поздней бластулы может быть причи­ной морфогенетических движений. Наблюдения показывают, од­нако, что эти различия невелики.

  Предполагают, что во внутренней цитоплазме клеток форми­руются параллельно расположенные волоконца, в связи с чем: клетки удлиняются, а это имеет значение при впячивании энто­дермы при гаструляции. Действительно, при гаструляции, напри­мер амфибий, инвагинирующие клетки оказываются длинными,. бутылкообразными. Однако неизвестно еще, почему клет­ки удлиняются и почему они принимают бутылковидную форму. Это явление, кажущееся причиной, нуждается в цитологическом и физико-химическом объяснении.

  Интересную гипотезу предложил И. Гольтфретер в 1943— 1944 г. для объяснения причин «втягивания» клеток в районе дорсальной губы бластопора при гаструляции у амфибий. Соглас^ но его наблюдениям у яиц амфибий, помимо студенистой и жел­точной оболочек, имеется еще тончайшая пленка, видимая в све­товой микроскоп, если на пленке адсорбируется краситель. Пленка эта — coat (от англ. coat,— одежда) покрывает клетки анимального полушария . Таким образом, дистальные концы клеток как бы прикреплены к coat, а большая, проксимальная часть клеток свободна от нее. В результате большой комплекс клеток как бы связан. Эластичная, растяжимая пленка — основ­ная структура, соединяющая поверхностно лежащие клетки в еди­ное целое и поддерживающая совокупность клеток, как «спаян­ную» массу.

При гаструляции отмечаются энергичные амебообразные дви­жения клеток в области дорсальной губы бластопора, но изолиро­ванными эти движения быть не могут, так как дистальные концы всех клеток связаны с их общей «одеждой». Сила натяжения и сократимость пленки противодействуют амебоидному движению и зависящему от него впячиванию клеток. Если клетка не отде­ляется от coat, то она, вытягиваясь, превращается в бутылкооб­разную  и даже нитевидную. Пленка заставляет клет­ки вести коллективный образ жизни. Как слагаемое их совмест­ных действий, при регулируемом влиянии coat происходит неиз­бежное впячивание групп клеток внутрь.

Логично предположение Гольтфретера и о том, что некоторые участки coat в ходе гаструляции окажутся внутри зародыша, coat будет препятствовать слипанию клеток и тем самым играть фор­мообразовательную роль при развитии просвета кишечника, нерв­ной трубки и почечных канальцев.

Агенты, уменьшающие силу натяжения поверхностной пленки или совершенно удаляющие ее (лишение Са, растворы с рН выше 9,6 или ниже 4,4 и др.), обусловливают экзогаструляцию. Так, по данным Гольтфретера, лимоннокислый натрий растворяет coat у амфибий, и происходит экзогаструляция.

ПРИЧИНЫ ГАСТРУЛЯЦИИ

Тщетно искать одни и те же причины морфогенетических движе­ний ' при гаструляциях разного типа, например при образовании деляминационной и инвагинационной гаструл. Однако не исклю­чено наличие и общих черт у кажущихся совершенно различных явлений.

Имеются исследования процессов гаструляции, осуществленные многими авторами. К сожалению, за единичными исключениями, все исследования проведены в основном на двух объектах — яйцах морских ежей и, в меньшей мере, на зародышах амфибий. Это означает, что экспериментальная эмбриология далеко не исчер­пала разнообразие явлений гаструляции при разных ее типах и •еще не в состоянии формулировать общие закономерности. По этой причине можно дать лишь иллюстрации подчас довольно про­тиворечивых фактов и гипотез, касающихся гаструляции.

1.   Причиной гаструляции некоторые эмбриологи считают не­равномерный рост в разных областях зародыша, точнее—неоди­наковые темпы деления клеток в разных частях зародыша. В слу­чае типичной эпиболической гаструлы, вероятно, следует прини­мать во внимание эту гипотезу, так как одной из причин обраста­ния анимальными бластомерами вегетативных несомненно явля­ется факт сильно замедленных темпов деления вегетативных блас-томеров. Также и при анализе механизма смешанных типов гаст­руляции, например у амфибий, одним из факторов гаструляции является, вероятно, неравномерный «рост». Однако эта давняя в эмбриологии гипотеза совершенно бессильна объяснить многие явления. Например, может и не быть делений клеток, а процессы гаструляции происходят. Из-за этого не следует вообще отказы­ваться от мысли о значении митотического градиента во время гаструляции, иллюстрацией чему служат наблюдения И. Агреля митотического градиента у зародыша морского ежа (Psammechi-nus tniliaris) 8—22-часового возраста (подсчитывались митозы в эктодерме, первичной мезенхиме, энтодерме и во вторичной ме­зенхиме) .

У 10-часовых зародышей обнаружено уменьшение числа мито­зов по направлению от анимального полюса бластулы к ве­гетативному. Через новые 3 ч в экваториальной области зародыша митозов оказывается меньше, чем у полюсов. Это распределение со­храняется до конца гаструляции. Автор считает, что инвагинация (энтодермальное впячивание) связана с локальным усилением митотической активности в области бластопора. Образование же первичной и вторичной мезенхимы зависит не от размножения клеток, а от миграции их.

2.  Л. Румблер в 1902 г. предложил объяснить гаструляцик? чисто механическим путем: клетки впячивающейся части изменя­ют форму, становятся «клиновидными», обращенные в полость бластулы концы клетки становятся более широкими, а концы, об­ращенные к внешней среде, суживаются. Вследствие этого и в ре­зультате давлений клеток друг на друга происходит втягивание данного участка пласта клегок внутрь. Изменение формы клеток обусловлено разницей в поверхностном натяжении с той и другой; стороны клеток.

Детекторы

При анализе микропримесей работают с селективными детекторами, чувствитель­ными к интересующему веществу. Предельная чувствительность детектора зависит от отношения сигнала к шуму самого детектора и от его способности реагировать на микропримеси в образце. Перед выполнением анализа необходимо эти микропримеси идентифицировать. Наиболее часто при анализе микропримесей применяют высокочувствительные фотометрические детекторы, работающие в УФ-области, и

спектрофотометры. УФ-фотометры, имеющие чувствительность более 0,002 е.о.п. на всю шкалу при шуме 1%, позволяют обнаруживать нанограммовые количества веществ, умеренно поглощающих в УФ-области, а флуориметры — даже пикограммовые. Для достижения максимальной чувствительности желательно работать при длине волны, соответствующей максимуму поглощения в УФ-спектре вещества. Получение со­ответствующих производных после колонки повышает селективность анализа и позволяет проводить его при максимальной предварительной очистке образца.

Примеси, способные к окислению или восстановлению в электролите, наиболее целесообразно определять чувствительными электрохимическими детекторами.

Калибровочные графики

При количественном анализе микропримесей не так важна высокая точность измерений, как их надежность, что достигается получением зон, свободных от посторонних соединений. Так как точность около 10% считается вполне удовлетворитель­ной, пики можно оценивать по их высоте, меньше зависящей от четкости отделения микропримеси от соседних зон, пики которых могут накладываться на пики анализируемых микропримесей. Хотя оценка по площадям пиков более точна, калибров­ка по высоте пиков удобнее.

В ВЭЖХ калибровочные графики микропримесей обычно линейны и проходят через начало координат. Чтобы избежать возможных частичных потерь образца, проводят калибровку методом внутреннего стандарта (по соотношению высот пиков), причем внутренний стандарт известной концентрации добавляют до предварительной обработки образца. В этом случае потери учитывают за счет эквивалентного изменения концентрации внутреннего стандарта и образца. Стандартный образец, близкий по свойствам микропримеси, добавляют, когда трудно выделить анализируемое вещество в чистом виде, чтобы построить калибровочный график. Подробнее калибровка по методу внутреннего стандарта рассмотрена в гл. 10.

При анализе сложных смесей, в частности в тех случаях, когда наблюдаются эффекты влияния матрицы или когда получение в чистом виде исходного образца, для которого строится калибровочный график, затруднительно, применяют метод добавления стандарта. Наличие других компонентов в образце может влиять на степень удерживания и (или) высоту пика интересующего вещества. Метод добавления стандарта состоит в следующем. Образец разделяют в хроматографе и измеряют высоту h_x интересующего нас пика. После этого добавляют известное весовое количество W_x вещества X и повторяют разделение, определяя высоту пика h'_x вещества X. Для вещества X строят калибровочный график и, определив калибровочный коэффициент Sx=(h'_x—h_x)/W_x, вычисляют количество вещества X в исходном образце как hJS_x. Для проверки ли­нейности графика берут несколько значений W_x. Метод добавления стандарта не обеспечивает поправки на нестабильность базовой линии, на помехи со стороны других компонентов и т.д. Эти помехи должны быть выявлены до добавления стандарта.

Методом, альтернативным методу добавления стандарта, является получение образца без анализируемого вещества и использование этого образца как матрицы для подготовки стандартов при обычной калибровке.

При определении микропримесей нужно придерживаться следующих рекомендаций.

1.   Проводить предварительное концентрирование образца, а в ряде случаев и предварительную его очистку.

2. Использовать большие объемы образца и короткие эффективные колонки, заполненные частицами сорбента менее 10 мкм, особенно микроколонки.

3.  Применять наиболее чувствительные детекторы с высоким отношением сигнала к шуму.

4. Применять хроматографические системы, обеспечивающие высокую разрешающую способность для микропримесей (ос>1,2) при относительно низких значениях к' (0,5—1,5).

Если это возможно, то разделение следует проводить в обращенно-фазном варианте, когда основной компонент выходит в зоне to. 5. Калибровку проводить по высоте пиков.