Ионная пара В+Р-

 

будет растворяться в полярной органической фазе, например в смеси спирта с хлороформом, а ионные формы будут растворяться в воде. Для определения ароматических сульфокислот применяют в качестве противоиона тетра-бутиламмоний, а для анализа хинина—сульфокислоты камфоры. В качестве противоиона обычно используют четвертичные или третичные амины, соли сульфокислот. Наиболее часто применяют тетраметил, тетрабутил, пальметилтриметиламмоний для анализа кислот, сульфированных красителей и третичные амины типа триоктиламина для анализа сульфонатов. Противоионами для анализа оснований являются соли алкил- и арилсульфокислот, перхлораты, пикраты.

Существует четыре варианта ион-парной хроматографии:

1)   адсорбционная хроматография, когда ионные пары вымываются элюентом с силикагеля;

2)   нормально-фазная распределительная хроматография, когда вода, нанесенная на пористую подложку, является неподвижной фазой, органический растворитель—элюентом;

3)   обращенно-фазная распределительная хроматография с органическим растворителем в качестве неподвижной фазы и водой в качестве элюента;

4)  обращенно-фазная хроматография, когда гидрофобный ион, образующий ионную пару, адсорбируется углеводородной частью неподвижной фазы. Иногда добавляют ПАВ, например цетилтриметиламмонийбромид (цетримид).

Ион-парную хроматографию применяют и для разделения амфотерных веществ. Когда ион-парную хроматографию применяют в нормально-фазном варианте в качестве противоионов, иногда используют ионы, способные к абсорбции света или к флуоресценции, для улучшения идентификации некоторых не поглощающих свет соединений. В этом варианте ион-парной хроматографии селективность системы изменяется за счет изменения полярности органической фазы. В табл. 3.4 приведены примеры использования ион-парной хроматографии при работе в режиме нормально-фазной хроматографии.

Однако наиболее часто применяют ион-парную хроматографию на обращенной фазе, при которой в качестве подвижной фазы используют водный буферный раствор и органический растворитель, смешивающийся с водой, обычно метанол или ацетонитрил. В подвижную фазу добавляют противоион, заряд которого противоположен заряду молекулы, а в качестве сорбента используют силикагель с химически привитой фазой, обычно Се или Ci8. Иногда разделение осуществляют с применением несмешиваемой с водой механически удерживаемой фазы, например, бутанола. При разделении на обращенной фазе более стабильной, чем механически удерживаемая фаза, водные образцы могут непосредственно вводиться в колонку, что особенно важно для анализа биологических образцов. При этом нет необходимости в предварительной очистке, так как гидрофильные компоненты мгновенно вызываются из колонки. Градиентное элюирование проводят, изменяя концентрацию противоиона в подвижной фазе или меняя полярность растворителя. При изменении концентрации противоиона, который остается в неподвижной фазе, изменяется сила растворителя, а при изменении рН подвижной фазы изменяется селективность разделения.

ИОН-ПАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ион-парная хроматография давно находила применение в жидкостной хроматографии и экстракции для извлечения лекарств и их метаболитов из биологических жидкостей в органическую фазу. Как самостоятельный раздел ВЭЖХ ион-парная хроматография, называвшаяся также экстракционной, парно-ионной, хрома­тографией с использованием ПАВ, хроматографией с жидким ионообменником, стала развиваться с середины 70-х годов. Метод занимает промежуточное положение между ионообменной хроматографией и адсорбционной, распределительной или обращенно-фазной. Недостатки ионообменных материалов, а именно невоспроизводимость от партии к партии, меньшая активность и стабильность по сравнению с другими сорбентами и небольшой выбор наполнительного материала, исключающий изменение селективности за счет сорбента, привел к некоторому ограничению применения ионооб­менной хроматографии. В ион-парной хроматографии большинство этих недостатков можно преодолеть. Метод ион-парной хроматографии характеризуется универсаль­ностью и обладает преимуществом по сравнению с классической ионообменной хроматографией, в котором активные центры фиксированы. Вследствие более быстрой массопередачи в ион-парной системе хроматографическое разделение более эффективно, чем на ионообменнике с фиксированными и активными зонами.

Ион-парную хроматографию используют для разделения образцов, содержащих как ионные, так и неионные соединения. Ее применяют в тех случаях, когда трудно или невозможно получить приемлемое разделение образца методом ионообменной хроматографии адсорбционной или обращенно-фазной. В некоторых случаях ионные соединения можно разделить на обращенной фазе, придавая им свойства неионных соединений (подавление ионов) с помощью буферного раствора с соответствующим рН, при котором равновесие смещается в сторону образования неионизированной формы. Полярные вещества, обладающие липофильными свойствами, делятся при этом на обращенной фазе как неполярные. Однако большинство наполнительных материалов колонок надежно работает только при рН=1,5—7,5. Исключение составляет партисил 5 ОДС, работающий при рН=1—8,5. В этом диапазоне рН сильные кислоты и основания ионизированы.

Попытки разделения сильных кислот и оснований методом подавления ионов оказываются неудачными из-за плохого удерживания веществ и асимметрии пиков. Соединения, остающиеся ионизированными в интервале рН=2—8, удовлетворительно разделяются методом ион-парной хроматографии, когда в подвижную фазу добавляют противоион, заряд которого противоположен заряду молекулы, и создается ион-парный комплекс, обладающий свойствами неполярного вещества. Если к ионному соединению, растворимому только в воде, добавить противоион, то образуется ионная пара, которая, обладая свойством растворяться в органической фазе, распределится между водным и органическим слоем. Возможна также адсорбция липофильной части противоиона в углеводородной фазе наполнительного материала. Очевидно, что катионы будут хорошо экстрагироваться анионами, и наоборот.

Получение производных после разделения в колонке

Реакция сводится к получению производных уже разделенных зон образца. Обычно требуется тщательный подбор аппаратуры и реагентов. Этот метод был применен Стайном и Муром для анализа аминокислот, не имеющих окраски. Амино­кислоты после выхода из колонки взаимодействуют с нингидрином, превращаясь в окрашенные соединения, способные поглощать свет на длине волны 570 нм и обнаруживаемые фотометром.

Имеются следующие отличия этого метода от метода получения производных до колонки:

1)   могут использоваться для одновременного обнаружения два детектора;

2) скорость реакции должна быть большой;

3) реактив не должен обнаруживаться детектором;

4)  использование элюента может мешать выбору реагентов из-за нерастворимости или возможной реакции;

5) обнаруживаемые вещества могут распадаться и разрушаться.

Требуется тщательное конструирование узлов оборудования, поскольку эффекты размывания зоны вне колонки могут быть значительными.  Продолжительность реакции должна быть не более 20 мин во избежание большого внеколоночного размывания. Другим ограничением почти для всех видов реакций является преобладание воды в окончательной смеси, и поэтому хроматографирование проводят лишь с водными подвижными фазами или с растворителями, смешивающимися с водой. Некоторые реагенты, приведенные в табл. 3.3, применимы и для получения производных до колонки.

Конструкция системы с получением производных после колонок должна обеспечить смешение вытекающей из колонки жидкости с реагентом и выдержку при некоторой температуре Т в течение такого-то времени t. Для обеспечения выдержки в период t на участке между колонкой и кюветой детектора возможны три подхода:

1)  применение короткого отрезка капиллярной трубки, позволяющей проводить реакцию за 10—30 с;

2)   использование короткой колонки, наполненной стеклянными шариками небольшого диаметра (выдержка до 3 мин);

3) использование сегментированного потока, что улучшает перемешивание и увеличивает продолжительность выдержки до 20 мин.

Следует также учесть, что реагенты и подвижная фаза должны быть смешиваемы, что размывание зон вне колонки увеличивается при использовании более вязких реакционных смесей и при увеличении времени реакции. Для предотвращений этих явле­ний часто предпочитают проводить реакцию при повышенных температурах.

При протекании быстрых реакций в несегментированном потоке в коротких трубках основное — это смешение реакционной смеси до ее поступления в кювету детектора. Для смешения применяют специально сконструированные тройники, на выходе которых устанавливают свернутую в спираль трубку («смесительная спираль»). Обычно применяют тефлоновые спирали с внутренним диаметром от 0,2 до 0,5 мм и длиной 10 м. Некоторые производные могут быть получены и без добавления реагента, непосредственно в хроматографе за счет фотохимической реакции.

Получение производных до введения вещества в колонку

Производные до введения вещества в колонку получать легче. Реакцию и очистку вещества обычно проводят вне хроматографа. Этот процесс может быть медленным, одноэтапным и многоэтапным, причем нет никаких ограничений при проведении реакций. Применяют любой растворитель или смесь растворителей, продолжительность реакции не ограничена. Реагент берут в избытке и удаляют перед введением в хроматограф, причем возможен широкий выбор реагентов.

Производные можно получать для многих классов органических соединений, если предварительно проводить химическое превращение интересующих нас веществ в соединения, способные давать производные. Например, гидролиз сложных эфиров приводит к получению кислот и спиртов. Уменьшение полярности производных по сравнению с таковой в исходном образце приводит к двум важным следствиям: менее полярные вещества регистрируются в виде более острых пиков с большим числом теоретических тарелок, у них уменьшается разброс значений к' и появляется возможность разделения в изократическом режиме вместо градиентного. У полученных производных выше значения а для выбранных пар веществ. Описаны производные, чувствительность определения которых на электрохимическом детекторе очень высока. Некоторые реагенты, применяемые для получения производных, приведены в табл. 3.2.

Получение производных до колонки имеет следующие недостатки. Некоторые образцы дают более одного продукта реакции для одного конкретного вещества и, следовательно, два или больше пиков на хроматограмме для индивидуального вещества. Реакция не всегда протекает полностью или доопределенного предела для каждого анализируемого образца. Наконец, управление ходом реакции вручную может оказаться трудоемким и связанным с большой потерей времени, чего не наблюдается при автоматическом режиме получения производных после колонки.

Некоторые фирмы выпускают специальное оборудование для получения производных в автоматизированном режиме, на котором можно проводить операции растворения, экстракции, обработки реагентами, повторной экстракции, фильтрации, выпаривания с растворением осадка другим растворителем и т.д.

ВЭЖХ С ПОЛУЧЕНИЕМ ПРОИЗВОДНЫХ ДО И ПОСЛЕ КОЛОНОЧНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

Использование не самого образца, а его производных в жидкостной хроматографии позволяет увеличить чувствительность и селективность метода. Иногда для получения производных необходимо предварительное концентрирование образца. Для многокомпонентных смесей обычно требуется предварительное разделение на более простые по составу фракции, чтобы исключить перекрытие зон в конечной хроматограмме или удалить примеси, влияющие на характеристики колонки. Некоторые соединения не обладают способностью поглощать свет, и для их определения с помощью высокочувствительных фотометрического или флуориметрического детекторов необходимо получить производные, регистрируемые этими детекторами. Присоединяя способную к флуоресценции группу к окси- или аминогруппе образца, можно обнаружить очень малые концентрации флуоресцирующих веществ.

Производные, полученные из экстрактов биоматериалов, имеют значительно меньшую полярность компонентов, что позволяет существенно изменить время их выхода и отделить от общей массы полярных соединений. Большинство реактивов, применяемых для модификации, реагирует с полярными группами образца, уменьшая его полярность. Уменьшение полярности полученных производных дает возможность применять адсорбционную хроматографию, а не обращенно-фазную, и легко отделить вещество от не вступивших в реакцию соединений. Полученные менее полярные производные экстрагируют и вводят в хроматограф. Таким образом очищают сложные загрязненные образцы фармацевтических или сельскохозяйственных препаратов, а также биохимические субстраты: мочу, плазму, сыворотку, кровь.

Чтобы разработать хороший способ модификаций, необходимо знать химическую структуру образца. Производные подбираются так, чтобы добиться хорошего отклика флуоресцентного или фотометрического детектора. Обработанный образец вводят в хроматограф для получения конечного разделения. Производные получают в тех случаях, когда необходимо:

1) отделение от матрицы интересующего нас соединения;

2)  улучшение разделения за счет снижения полярности или изменение значений а выбранных пар компонентов;

3) повышение отклика детектора на конкретные компоненты образца;

4)  изменение отклика детектора на различные компоненты образца, в результате чего могут количественно оцениваться интересующие нас вещества даже при наличии перекрывающихся зон не интересующих нас соединений. Две последние причины наиболее актуальны. Производные получают и в случае нестойких веществ, которые могли бы разложиться в хроматографе. Так обрабатывают арилгидроксиламины метилизоцианатом, переводя их в карбамиды.

Общие аспекты получения производных в жидкостной хроматографии в целях повышения чувствительности подробно рассмотрены в литературе. Производные могут быть получены до введения вещества в колонку и после разделения его на хроматографической колонке перед прохождением детектора.

установление пригодности растворителей

Единственным путем установления пригодности растворителей для ГВЭЖХ служит проверка в реальных хроматографических условиях с градиентом требуемого состава, но без введения пробы вещества (холостой градиент). Как правило, проверку проводят сначала на более грубых шкалах детектора и при длинах волн 254 или 280 нм, а при получении положительного результата переходят на более чувствительные шкалы и длины волн 220 нм и ниже. Если работа по ГВЭЖХ прервана на относительно большой срок (более недели) или один из растворителей (или оба) заменены на новые (даже той же квалификации и партии), всегда следует до начала работы с образцами создать холостой градиент для проверки работоспособности системы в целом.

Следует отметить, что многие добавки к растворителям, такие, как соли, кислоты, ион-парные и другие реагенты, способны заметно изменить свойства растворителей. Так, накопление полифосфатов в солях фосфорной кислоты, используемых для приготовления буферных растворов, приводит к существенному дрейфу при градиенте из-за сильного УФ-поглощения полифосфатов. В некоторых случаях удается уменьшить дрейф в градиентном режиме, если уравнять УФ-поглощение слабого и сильного

элюирующих растворов добавкой УФ-поглотителя, такого, как ацетон, к менее УФ-поглощающему раствору. Градиент тем легче осуществить, чем он меньше по диапазону, поэтому целесообразно менять растворитель по составу только в тех пределах, которые необходимы для разделения. Это позволяет повысить чувствительность, уменьшить дрейф нулевой линии и количество ложных пиков, а также ускорить как элюирование, так и возврат системы к исходным условиям для нового анализа.

Если при градиентном элюировании используют другой тип детектора, например флюориметрический, высокие требования к чистоте растворителей остаются, но меняется их направленность — не должно быть флюоресцирующих примесей. О пригод­ности растворителей для работы судят также, осуществляя холостой градиент.

В заключение отметим, что к градиентному элюированию следует прибегать только в тех случаях, когда его применение является единственным путем решения данной проблемы. Если проверка в градиентном режиме показала, что возможно использовать изократический вариант для интересующих .веществ, следует немедленно перейти к нему. Это всегда выгодно, даже в тех случаях, когда анализ разбивается на два изократичеоких, выполняемых на двух приборах с более сильным и более слабым растворителями. Более воспроизводимые результаты и возможность использовать более чувствительные шкалы, менее жесткие требования к качеству растворителя — это только некоторые из получаемых преимуществ.

Следует также отметить, что при работе в обращенно-фазном режиме с системой метанол — вода, вязкость которой не аддитивна, а меняется от 1 до 1,5 и затем до 0,6 Мпа*с при переходе от 100% воды к 100% метанола, колонка находится в неблагоприятных условиях, так как при постоянном расходе давление на колонку сначала возрастает в 1,5 раза, а затем падает в 2 раза к концу градиентного элюирования. Картина повторяется в процессе регенерации колонки, при возврате к слабому растворителю. Это сокращает срок службы колонки и затрудняет работу с колонками, содержащими мелкий сорбент (менее 5 мкм).

в случае обращенно-фазной ГВЭЖХ

 

Наконец, очень важно правильно выбрать растворитель и добавки для него при ГВЭЖХ. Если при изократической ВЭЖХ небольшие примеси, присутствующие в растворителе, приходят в равновесие с сорбентом и обычно не дают ложных пиков или увеличения шумов, то в ГВЭЖХ требования к чистоте растворителей значительно более жесткие. Например, в случае обращенно-фазной ГВЭЖХ использование воды, недостаточно очищенной от органических загрязнителей, присутствующих в природной воде или привнесенных в процессе ионообменной очистки или перегонки, приводит к появлению набора интенсивных пиков, элюируемых из колонки метанольно-водным или ацетонитрильно-водным градиентом. Перегонка воды часто приводит (если аппаратура выбрана неудачно) не к уменьшению, а к увеличению количества и содержания органических загрязнителей, добавляющихся при контакте воды с недостаточно чистой аппаратурой, полимерными пробками и шлангами, смазками на органической основе и т.д. Кроме того, многие органические вещества, малолетучие сами по себе, способны легко перегоняться с водяным паром и, следовательно, загрязнять конденсат. Наиболее надежным методом очистки воды для ГВЭЖХ следует признать двукратную дистилляцию в стеклянной или кварцевой аппаратуре на шлифах, при этом на первой стадии проводится окисление примесей перманганатом калия, а на второй — обработка щелочью для удаления кислых веществ. Если после этого необходима дополнительная очистка, ее проводят пропусканием воды через колонку большого диаметра с крупным (30—100 мкм) обращенно-фазным сорбентом, используемым для препаративной работы и относительно дешевым. Хранить такую высокочистую воду желательно в темном месте в бутыли, тщательно закрытой пробкой. Вода не должна контактировать с полимерами, выделяющими в нее продукты деструкции, стабилизаторы, пластификаторы и другие загрязнители. Желательно не хранить высокочистую воду длительный срок, так как ее чистота сохраняется относительно недолго.

Другие растворители для ГВЭЖХ должны быть квалификации «для УФ-спектроскопии» или «для жидкостной хроматографии». Производство ацетонитрила и метанола, а также воды таких квалификаций освоено нашей промышленностью. При хранении, а также использовании таких растворителей всегда следует помнить о потенциальных загрязнителях и по мере возможности избегать их.

Примеси, находящиеся в метаноле или ацетонитриле, точно так же могут накапливаться на колонке и проявляться в виде пиков при градиенте. Это легко понять, если представить себе, что начальный состав растворителя органический компонент — вода 50 : 50. Невымываемая таким растворителем примесь, например нафталин, может быть добавлена как в воду, так и в метанол и будет накапливаться в начале колонки одинаково независимо от компонента системы растворителей, ее содержащего (метанола или воды). Если спустя какое-то время начать градиентное элюирование, наф­талин при более сильном растворителе начнет двигаться и выйдет в виде узкого пика.

Наиболее жесткие требования предъявляют к растворителю если градиент осуществляется с детектированием при длинах волн ниже 220 или 210 нм, так как в этом случае поглощают и проявляются в виде пиков многие примеси, УФ-прозрачные при 254 или 280 нм.