Одной из биологических особенностей клеток

 

является их способность к амебоидным движениям и фагоцитозу. Эти две черты — отражение древнейших свойств клеточных существ. Б. П. Токин в 1955 г. в связи с проблемой иммунитета зародышей предполагал, что следует придавать значение важному обстоя­тельству: потенциально всем жизнедеятельным клеткам любых тканей, принадлежащих организмам любой степени сложности, свойственны фагоцитарная способность и амебоидная подвиж­ность (см. гл. XV). Эта способность находится под «арестом» ин­теграции тканей благодаря взаимным влияниям клеток и, веро­ятно, еще неизвестным факторам биологической и физико-хими­ческой природы. Взаимное влияние клеток имеется уже на са­мых ранних стадиях развития зародыша в эпителиального типа пластах, как и в любом скоплении клеток. В случае нарушения состояния интеграции и освобождения их от обычных корреляций клетки начинают проявлять способность к амебоидному движению и к фагоцитарным реакциям.

Впервые Гольтфретером показано, что если зародыши амфибий на стадии бластулы, гаструлы или нейрулы дезинтегрировать (до­биться химическими способами диссоциации зародыша на отдельные клетки и группы их), то проявляется фагоцитарная актив­ность одиночных клеток.

Таким образом, способность клеток зародыша к амебоидной подвижности является прочно установленным экспериментами фактом. Это помогает объяснять поведение одиночных клеток и их групп, наблюдаемое в ходе гаструляции, происходящей по типу униполярной и мультиполярной иммиграции. Одним из моментов морфогенетических движений при гаструляции у морского ежа яв­ляется активное перемещение клеток внутрь бластоцеля. Несом­ненно, и при смешанных типах гаструляции, например у амфибий, способность к амебоидным движениям клеток играет важную роль. Несколько искусственно сближать явления фагоцитоза с про­цессами обволакивания анимальными бластомерами вегетатив­ных, наблюдающихся при гаструляции, которая происходит по типу эпиболии, хотя не исключена возможность того, что эти процессы имеют общую морфофизиологическую основу в жизни клеток.

электронно-микроскопические снимки заро­дышей амфибий

Эти мысли очень подкупают своей ясностью. Однако Б. Балин-ский в 1961 г., изучая электронно-микроскопические снимки заро­дышей амфибий, не обнаружил ни coat, ни вообще каких-либо мембран, помимо известных оболочек яйца амфибий. Грустно от­казываться от оригинальной гипотезы Гольтфретера. Может быть, в этом нет надобности, так как и Балинский утверждает, что ди­стальные концы клеток очень прочно соединены между собой бла­годаря каким-то «цементирующим» субстанциям, являющимся экскрецией самих клеток. Координирующим механизмом морфо-генетических движении могут быть, вероятно, и другие клеточные структуры, например нитевидные отростки клеток. Таким обра­зом, их поведение в районе дорсальной губы бластопора можно объяснить исходя из предположений Гольтфретера, но заменив слишком прямолинейные представления о coat как пленке и о ме­ханизме движения более физиологической теорией.

Для анализа процессов гаструляции, как и других морфо-генетических движений клеток и клеточных масс, следует все больше привлекать многочисленные цитологические данные о раз­ных типах связей между клетками, обнаруживаемых химически­ми и электронно-микроскопическими исследованиями. Одним из инициаторов изучения взаимодействия между клетками является английский исследователь М. Эберкромби, а также Дж. Картис.

Характер сцепления между клетками, разная степень слипа­ния, структура межклеточных пространств и другие факторы игра­ют, по-видимому, огромную роль во всех явлениях формообразо­вания, в том числе и в процессах гаструляции. Связи между клетками могут быть разнообразными: выросты мембран клеток, выпускание псевдоподий, ундулирующие мембраны (пластинча­тые выросты, способные волнообразно колебаться) и т. п.

Между клетками даже таких плотных тканей, как эпителии, никогда не бывает полного контакта, всегда существует между их мембранами пространство (60 нм и более). Большие простран­ства между клетками (до долей мк) наблюдаются в мезенхим-ных тканях. Пространства между клетками — не пустота, они за­полнены веществами — продуктами жизнедеятельности клеток. Старые представления о клетках как стабильных кирпичиках и тканях как стабильных сооружениях из иих следует целиком оставить. Клетки могут скользить своими поверхностями, они никогда не бывают в покое, если они живы, и стабильность сооружений — тканей и органов — объясняется не тем, что клетки находятся в мертвом, неподвижном состоянии, а иными надкле-точными закономерностями. В этом отношении возможна анало­гия архитектоники живых существ с физическим состоянием твер­дых тел, «твердость» которых отнюдь не объясняется неподвиж­ностью молекул. Последние находятся всегда в движении. Но архитектоника пластов клеток может сильно меняться при нор­мальных процессах формообразования, и клетки, освобожденные из общих связей, могут проявлять скрытые до того потенции.

ПРАВИЛА О. ГЕРТВИГА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

К АНАЛИЗУ РАЗВИТИЯ АМФИБИЙ, РЫБ, ПТИЦ И НАСЕКОМЫХ

Уже упоминалось о большом значении, которое придает эмбрио­логия правилам О. Гертвига для понимания причин разных типов дробления яиц.

Первое правило Гертвига: ядро занимает центр активной протоплазмы (полностью или почти полностью свободной от желтка). В алецитальных и изолецитальных яйцах ядро располо­жено ближе к центру а у телолецитальных оно рас­полагается эксцентрично, в анимальном полушарии.

Второе правило Гертвига: веретено деления ядра располага­ется в направлении наибольшей протяженности чистой протоплаз­мы

Ярким примером правильности этих утверждений служит характер дробления телолецитальных яиц амфибий. Ядро у них, как уже сказано, расположено в анимальном полушарии. Наи­большая протяженность чистой протоплазмы параллельно эквато­риальной плоскости . В этом направлении и окажется веретено первого деления ядра. Кариокинетический процесс связан с передвижением различных составных частей клетки, ее хромосом, частей цитоплазмы, корти­кального слоя. Классическая описатель­ная гистология и цитология, так много давшие биологии с - их методиками фиксации и окрашивания клеток, при­вивают, однако, изучающему клетки, тка­ни и развитие организма совершенно не соответствующее действительности представление о клетках, как о чем-то неподвижном. Мы неоднократно будем убеждаться в том, что такое представле­ние о клетках необоснованно.

Различного рода закономерным дви­жениям составных частей ядра и цитоплазмы могут мешать зерна и пластинки желтка. Если желток. расположен очень компактно, то процесс дробления в определен­ном участке яйца может подавляться.

Первая борозда дробления у яиц амфибий определяется ука­занным направлением веретена деления ядра (параллельно эква­ториальной плоскости, иначе — перпендикулярно к анимально-вегетативной оси яйца). Поэтому дробление произойдет в плоскости одного из меридианов яйца

Близкие к этому представлению мысли высказал

 

в 1941 г. А. Р. Мур в связи с анализом формы клеток при нейруляции

  Предполагают, что неодинаковая интенсивность поглощения воды различными клетками поздней бластулы может быть причи­ной морфогенетических движений. Наблюдения показывают, од­нако, что эти различия невелики.

  Предполагают, что во внутренней цитоплазме клеток форми­руются параллельно расположенные волоконца, в связи с чем: клетки удлиняются, а это имеет значение при впячивании энто­дермы при гаструляции. Действительно, при гаструляции, напри­мер амфибий, инвагинирующие клетки оказываются длинными,. бутылкообразными. Однако неизвестно еще, почему клет­ки удлиняются и почему они принимают бутылковидную форму. Это явление, кажущееся причиной, нуждается в цитологическом и физико-химическом объяснении.

  Интересную гипотезу предложил И. Гольтфретер в 1943— 1944 г. для объяснения причин «втягивания» клеток в районе дорсальной губы бластопора при гаструляции у амфибий. Соглас^ но его наблюдениям у яиц амфибий, помимо студенистой и жел­точной оболочек, имеется еще тончайшая пленка, видимая в све­товой микроскоп, если на пленке адсорбируется краситель. Пленка эта — coat (от англ. coat,— одежда) покрывает клетки анимального полушария . Таким образом, дистальные концы клеток как бы прикреплены к coat, а большая, проксимальная часть клеток свободна от нее. В результате большой комплекс клеток как бы связан. Эластичная, растяжимая пленка — основ­ная структура, соединяющая поверхностно лежащие клетки в еди­ное целое и поддерживающая совокупность клеток, как «спаян­ную» массу.

При гаструляции отмечаются энергичные амебообразные дви­жения клеток в области дорсальной губы бластопора, но изолиро­ванными эти движения быть не могут, так как дистальные концы всех клеток связаны с их общей «одеждой». Сила натяжения и сократимость пленки противодействуют амебоидному движению и зависящему от него впячиванию клеток. Если клетка не отде­ляется от coat, то она, вытягиваясь, превращается в бутылкооб­разную  и даже нитевидную. Пленка заставляет клет­ки вести коллективный образ жизни. Как слагаемое их совмест­ных действий, при регулируемом влиянии coat происходит неиз­бежное впячивание групп клеток внутрь.

Логично предположение Гольтфретера и о том, что некоторые участки coat в ходе гаструляции окажутся внутри зародыша, coat будет препятствовать слипанию клеток и тем самым играть фор­мообразовательную роль при развитии просвета кишечника, нерв­ной трубки и почечных канальцев.

Агенты, уменьшающие силу натяжения поверхностной пленки или совершенно удаляющие ее (лишение Са, растворы с рН выше 9,6 или ниже 4,4 и др.), обусловливают экзогаструляцию. Так, по данным Гольтфретера, лимоннокислый натрий растворяет coat у амфибий, и происходит экзогаструляция.

ПРИЧИНЫ ГАСТРУЛЯЦИИ

Тщетно искать одни и те же причины морфогенетических движе­ний ' при гаструляциях разного типа, например при образовании деляминационной и инвагинационной гаструл. Однако не исклю­чено наличие и общих черт у кажущихся совершенно различных явлений.

Имеются исследования процессов гаструляции, осуществленные многими авторами. К сожалению, за единичными исключениями, все исследования проведены в основном на двух объектах — яйцах морских ежей и, в меньшей мере, на зародышах амфибий. Это означает, что экспериментальная эмбриология далеко не исчер­пала разнообразие явлений гаструляции при разных ее типах и •еще не в состоянии формулировать общие закономерности. По этой причине можно дать лишь иллюстрации подчас довольно про­тиворечивых фактов и гипотез, касающихся гаструляции.

1.   Причиной гаструляции некоторые эмбриологи считают не­равномерный рост в разных областях зародыша, точнее—неоди­наковые темпы деления клеток в разных частях зародыша. В слу­чае типичной эпиболической гаструлы, вероятно, следует прини­мать во внимание эту гипотезу, так как одной из причин обраста­ния анимальными бластомерами вегетативных несомненно явля­ется факт сильно замедленных темпов деления вегетативных блас-томеров. Также и при анализе механизма смешанных типов гаст­руляции, например у амфибий, одним из факторов гаструляции является, вероятно, неравномерный «рост». Однако эта давняя в эмбриологии гипотеза совершенно бессильна объяснить многие явления. Например, может и не быть делений клеток, а процессы гаструляции происходят. Из-за этого не следует вообще отказы­ваться от мысли о значении митотического градиента во время гаструляции, иллюстрацией чему служат наблюдения И. Агреля митотического градиента у зародыша морского ежа (Psammechi-nus tniliaris) 8—22-часового возраста (подсчитывались митозы в эктодерме, первичной мезенхиме, энтодерме и во вторичной ме­зенхиме) .

У 10-часовых зародышей обнаружено уменьшение числа мито­зов по направлению от анимального полюса бластулы к ве­гетативному. Через новые 3 ч в экваториальной области зародыша митозов оказывается меньше, чем у полюсов. Это распределение со­храняется до конца гаструляции. Автор считает, что инвагинация (энтодермальное впячивание) связана с локальным усилением митотической активности в области бластопора. Образование же первичной и вторичной мезенхимы зависит не от размножения клеток, а от миграции их.

2.  Л. Румблер в 1902 г. предложил объяснить гаструляцик? чисто механическим путем: клетки впячивающейся части изменя­ют форму, становятся «клиновидными», обращенные в полость бластулы концы клетки становятся более широкими, а концы, об­ращенные к внешней среде, суживаются. Вследствие этого и в ре­зультате давлений клеток друг на друга происходит втягивание данного участка пласта клегок внутрь. Изменение формы клеток обусловлено разницей в поверхностном натяжении с той и другой; стороны клеток.

Детекторы

При анализе микропримесей работают с селективными детекторами, чувствитель­ными к интересующему веществу. Предельная чувствительность детектора зависит от отношения сигнала к шуму самого детектора и от его способности реагировать на микропримеси в образце. Перед выполнением анализа необходимо эти микропримеси идентифицировать. Наиболее часто при анализе микропримесей применяют высокочувствительные фотометрические детекторы, работающие в УФ-области, и

спектрофотометры. УФ-фотометры, имеющие чувствительность более 0,002 е.о.п. на всю шкалу при шуме 1%, позволяют обнаруживать нанограммовые количества веществ, умеренно поглощающих в УФ-области, а флуориметры — даже пикограммовые. Для достижения максимальной чувствительности желательно работать при длине волны, соответствующей максимуму поглощения в УФ-спектре вещества. Получение со­ответствующих производных после колонки повышает селективность анализа и позволяет проводить его при максимальной предварительной очистке образца.

Примеси, способные к окислению или восстановлению в электролите, наиболее целесообразно определять чувствительными электрохимическими детекторами.

Калибровочные графики

При количественном анализе микропримесей не так важна высокая точность измерений, как их надежность, что достигается получением зон, свободных от посторонних соединений. Так как точность около 10% считается вполне удовлетворитель­ной, пики можно оценивать по их высоте, меньше зависящей от четкости отделения микропримеси от соседних зон, пики которых могут накладываться на пики анализируемых микропримесей. Хотя оценка по площадям пиков более точна, калибров­ка по высоте пиков удобнее.

В ВЭЖХ калибровочные графики микропримесей обычно линейны и проходят через начало координат. Чтобы избежать возможных частичных потерь образца, проводят калибровку методом внутреннего стандарта (по соотношению высот пиков), причем внутренний стандарт известной концентрации добавляют до предварительной обработки образца. В этом случае потери учитывают за счет эквивалентного изменения концентрации внутреннего стандарта и образца. Стандартный образец, близкий по свойствам микропримеси, добавляют, когда трудно выделить анализируемое вещество в чистом виде, чтобы построить калибровочный график. Подробнее калибровка по методу внутреннего стандарта рассмотрена в гл. 10.

При анализе сложных смесей, в частности в тех случаях, когда наблюдаются эффекты влияния матрицы или когда получение в чистом виде исходного образца, для которого строится калибровочный график, затруднительно, применяют метод добавления стандарта. Наличие других компонентов в образце может влиять на степень удерживания и (или) высоту пика интересующего вещества. Метод добавления стандарта состоит в следующем. Образец разделяют в хроматографе и измеряют высоту h_x интересующего нас пика. После этого добавляют известное весовое количество W_x вещества X и повторяют разделение, определяя высоту пика h'_x вещества X. Для вещества X строят калибровочный график и, определив калибровочный коэффициент Sx=(h'_x—h_x)/W_x, вычисляют количество вещества X в исходном образце как hJS_x. Для проверки ли­нейности графика берут несколько значений W_x. Метод добавления стандарта не обеспечивает поправки на нестабильность базовой линии, на помехи со стороны других компонентов и т.д. Эти помехи должны быть выявлены до добавления стандарта.

Методом, альтернативным методу добавления стандарта, является получение образца без анализируемого вещества и использование этого образца как матрицы для подготовки стандартов при обычной калибровке.

При определении микропримесей нужно придерживаться следующих рекомендаций.

1.   Проводить предварительное концентрирование образца, а в ряде случаев и предварительную его очистку.

2. Использовать большие объемы образца и короткие эффективные колонки, заполненные частицами сорбента менее 10 мкм, особенно микроколонки.

3.  Применять наиболее чувствительные детекторы с высоким отношением сигнала к шуму.

4. Применять хроматографические системы, обеспечивающие высокую разрешающую способность для микропримесей (ос>1,2) при относительно низких значениях к' (0,5—1,5).

Если это возможно, то разделение следует проводить в обращенно-фазном варианте, когда основной компонент выходит в зоне to. 5. Калибровку проводить по высоте пиков.

Разрешающая способность колонки

Иногда удается провести разделение на обращенной фазе таким образом, что основные компоненты образца элюируются со временем, близким к to, а микропримеси удерживаются на колонке, что облегчает их количественное определение. Оценка содержания микропримеси наиболее надежна, когда ее пик регистрируется до пика преобладающего в образце компонента. Элюирование пика микропримеси на хвосте преобладающего компонента сильно ухудшает ее количественное определение. Любое хроматографическое разделение на колонке приводит к разбавлению образца. При анализе микропримесей возникает проблема разделения при минимальном разбавлении. Степень разбавления введенного образца может быть выражена уравнением

С макс/Со = VsN°'⁵/[Vr(27i)⁰'⁵],

где Смакс — Концентрация, соответствующая максимуму пика; Со — исходная концентрация в образце; Vs — вводимый объем; N — число теоретических тарелок для данной колонки; Vr — удерживаемый объем микропримеси.

Из уравнения видно, что снижения степени разбавления, .а значит, увеличения чувствительности определения микропримеси можно достигнуть за счет увеличения вводимого объема, использования колонки с большим числом теоретических тарелок или за счет снижения объема удерживания микропримеси. К увеличению N ведет применение эффективных колонок, заполненных частицами с размером менее 10 мкм. При анализе микропримесей желательно применение коротких колонок (5—10 см) с размером частиц 3—5 мкм.

Большое влияние при анализе микропримесей оказывает изменение селективности системы и повышение коэффициента разделения а, что достигается изменением состава подвижной фазы и выбором оптимального хроматографического режима. Кроме того, как видно из уравнения

Смакс/Со =(0С—1 )/0С

изменение селективности может значительно снизить степень разбавления пика.