РАЗВИТИЕ ЭПИДЕРМИСА И ОРГАНОВ, В ОБРАЗОВАНИИ КОТОРЫХ ОН УЧАСТВУЕТ

Большая часть эктодермы, остающейся на поверхности зароды­ша после нейруляции, развивается в эпидермис кожи. Но мы уже знаем, что и различные другие структуры являются дери­ватами эктодермы. Она участвует в формировании глаза, так как из нее развиваются хрусталик и роговица. Большое число других органов и частей органов развиваются в связи с дифференциацией эпидермиса: перья, чешуи, потовые и сальные же­лезы, млечные железы у млекопитающих.

Эпидермис раннего эмбриона птиц и млекопитающих снача­ла состоит из одного слоя клеток. У куриного зародыша он, диф­ференцируясь взаимозависимо с подлежащей соединительной тканью, на 7-й день развития становится двухслойным. Лишь на поздних стадиях развития птиц и млекопитающих возникает внутренний листок, состоящий из ряда слоев размножающихся клеток, — так называемый мальпигиев слой эпидермиса. У ку­риного зародыша на 17-й день эпидермис становится многослой­ным. В теснейшей взаимозависимости дифференцируются эпите­лий и соединительно-тканная часть кожи — дерма. Вместе они и составляют кожу как орган. Соединительно-тканная часть кожи развивается из мезенхимы, являющейся производной мезодер-мального пласта зародыша (дерматом), и нервного гребня. Нерв­ный гребень в начале своего появления после смыкания нервной пластинки в медуллярную трубку представляет массу клеток, лежащих на месте бывшего смыкания краев медуллярной пла­стинки. Этот клеточный материал, мигрируя от места происхож­дения в латеральном и вентральном направлениях, у разных позвоночных участвует в образовании многих структур (жабр, частей лицевого скелета и т. д.). Висцеральный скелет, напри­мер, полностью развивается из клеточного материала нервного гребня.

У амфибий эпителий ранних эмбрионов двухслойный. Наруж­ный листок называется перидермой, а внутренний — сенсорным, потому что он принимает участие в образовании некоторых орга­нов чувств.

Начальные этапы развития многих структур — производных эпидермиса — сходны в том отношении, что сначала образуются локальные утолщения эпидермального эпителия. Эти пластинко-образные утолщения называются плакодами. В соответствующих местах возникают парные плакоды, производными которых явля­ются обонятельные мешки, черепные нервы, слуховые пузырьки и др. Из плакод, находящихся в соседстве со слуховыми, раз­виваются органы чувств боковой линии. У рыб боковая линия тянется вдоль всего тела, однако вся она образована плакодами, возникающими в области развития органа слуха.

Зачатком обонятельной выстилки органа обоняния служит пе­редняя, впоследствии обособляющаяся часть нервной пластинки.

Согласно данным Н. Джакобсона

 

(1966), индуцирующее влия­ние на эктодерму, подготовляющее детерминацию линзовой за­кладки, осуществляется не только глазным зачатком, но и энто­дермой, и презумптивной сердечной мезодермой.

Столь подробное изложение опытов, касающихся развития хрусталика, важно потому, что, как увидим в гл. XI, упоминав­шиеся интересные данные классических работ Г. Ш^емана и В. Льюиса послужили толчком для создания в 30-х годах Г. Шпеманом теории индивидуального развития, главенствовав­шей в эмбриологических исследованиях более двух десятилетий. Другие добавочные структуры глаза — сосудистая оболочка, склера, или, иначе, белочная оболочка, и роговица — обеспечи­вают его функцию.

Наружные оболочки глаза (сосудистая и склера) образуются из мезенхимы, окружающей развивающийся глазной бокал. Внут­ренний слой клеток мезенхимы развивается в сеть кровеносных сосудов, окружающих пигментный эпителий. Это и есть закладка сосудистой оболочки. Наружная масса мезенхимных клеток — источник формирования склеры — преобразуется в фиброзную капсулу, играющую защитную роль и служащую местом прикреп­ления мышц глаза.

У птиц и рептилий капсула становится хрящевой и даже кост­ной, у других позвоночных она остается фиброзной.

Сосудистая и белочная оболочки вначале прилегают друг к другу по всей поверхности глазного яблока. Впоследствии между ними, в передней части, возникает пространство — передняя ка­мера глаза. Склера становится в этом месте прозрачной и уча­ствует в образовании роговицы- (cornea). Соответствующий же участок сосудистой, оболочки идет на построение наружного со-единительне-тканного слоя радужной оболочки и покрывающей хрусталик зародыша сосудистой оболочки.

Как уже сказано, роговица развивается из эпидермального эпителия и мезенхимы. Эпителий и соединительная ткань буду­щей роговицы в ходе развития глаза становятся прозрачными. Покрывающий глаз эпителий пигментирован.

Многочисленными экспериментами Г. Шпемана (1901) и О. Мангольда (1931) доказано, что превращение участка кожи в роговицу зависит- от причинных» влияний, идущих от хруста­лика и всего глазного бокала. Если удалить глазное яблоко до образования роговицы, то она не развивается. Зависимость рого­вицы от всех остальных частей глаза сохраняется все время. Если удалить глаз у личинки амфибий или у взрослого живот­ного, то роговица вскоре теряет прозрачность и постепенно при­обретает структуру кожи.

У различных позвоночных неодинаковое строение различных добавочных структур глаза. У двухмесячного зародыша человека по верхнему и нижнему краям роговицы возникают две складки кожи. Это будущие верхнее и нижнее веки. На третьем месяце эти складки, разрастаясь, временно срастаются. Полость между веками и роговицей глаза называется конъюнктивальным меш­ком.

Если удалить зачаток глаза

 

(глазной пузырь или начинаю­щий формироваться глазной бокал) и предотвратить контакт глаз­ного пузыря с эпидермисом, то, как правило, линза не возникает. Эксперименты такого рода сами по себе еще не убеждают пол­ностью в «индукционной» способности глазного пузыря. Во-пер­вых, эти эксперименты грубые, так как резко нарушают нор­мальное состояние клеточных масс в зародыше. Во-вторых, дело осложняется тем, что не всегда достигается положительный ре­зультат в таких опытах. К тому же у некоторых амфибий (Rana esculenta, Xenopus laevis и др.) обнаружена некоторая степень «независимого» развития хрусталика, когда предварительно уда­лялся презумптивный материал глаза на стадии нейрулы. Раз­витие в этих случаях никогда не бывает нормальным, но нередко формируются довольно типичные линзы с соответствующими ци-топлазматическими преобразованиями клеток в волокнистые структуры. Однако эти вселяющие сомнение факты требуют осо­бого анализа и не опровергают основных данных о влиянии глазного пузыря на эпидермис, из которого возникает хрусталик.

Демонстративные результаты дают опыты, в которых уда­лялся презумптивный эпидермис линзы и на его место переса­живался эпидермис, взятый с какой-либо другой части зародыша, например с головы или брюха. Эпидермис побуждался в этих опытах к развитию линзы.

Наконец, убедителен и третий тип экспериментов. Если вы­резать глазной пузырь и трансплантировать его под эпидермис в другой части тела зародыша, то иногда эпидермис развивает­ся в линзу.

Считается, что для индукции хрусталика необходим непосред­ственный контакт эпидермиса с глазным пузырем: Мэк Кийен в 1951 г. показал, что помещение между глазным пузырем и эпи­дермисом тонкого листочка целлофана (в опытах на курином зародыше) предотвращает индукционное действие глазного пу­зыря. Однако тот же исследователь в опытах 1958 г. (также на курином зародыше) доказал, что частичное экранирование эпи­дермиса от глазного пузыря тонкой полоской агара не предот­вращает полноценного развития хрусталика. Если индуцирующий агент химической природы, то он должен был в этих опытах или проходить через агар, или обойти вокруг него.

Химическая природа индуцирующего действия глазного пузы­ря пока неясна. Есть предположения, отчасти подтверждаемые экспериментами, что когда глазной пузырь приходит в контакт с эпидермисом, он содержит большое количество, РНК, а пре-зумптивный хрусталиковыи эпидермис имеет мало нуклеиновых кислот. После контакта глазного пузыря с эпидермисом появ­ляется большое количество РНК и в эпидермисе. Может быть, молекулы нуклеиновых кислот проходят от клеток глазного пу­зыря в клетки презумптивной линзы. Однако если бы это и ока­залось так (что не удается пока доказать), нелегко дать хими­ческую интерпретацию индукционной роли глазного пузыря в образовании линзы.

Некоторые исследователи (например, Б. И. Балинский, 1961) предполагают, что индукционное воздействие на презумптивный линзовый эпителий исходит не только из глазного пузыря, но и из головной мезодермы, и делают попытку объяснить причины обнаруженных многими авторами отклонений в результатах опы­тов по индукции хрусталика глазным бокалом.

У амфибий и костистых рыб только внутренний листок

 

эпи­дермиса принимает участие в утолщении; это утолщение отде­ляется от эпидермиса в виде очень плотной массы клеток, ко­торые, перегруппировываясь, образуют хрусталик. При любом типе формирования хрусталиков в них происходят сложные ци­тологические преобразования. Клетки внутренней стороны пу­зырька будущей линзы удлиняются.и постепенно преобразуются в длинные волокна. Ядра клеток дегенерируют, цитоплазма де­лается плотной и прозрачной. Волокна располагаются не беспо­рядочно, а в строго закономерном направлении; при этом и формируется сферическое, или эллипсоидное, преломляющее свет тело линзы. Но часть линзового эпителия таким образом не из­меняется и покрывает измененную часть. Возникает точка роста линзы — место соединения неизменного эпителия с массой волокон линзы. Это, фигурально выражаясь, мастерская линзооб-разования. В этом месте эпителиальные клетки непрерывно пре­вращаются в волокна, линза растет.

На примере развития глаза экспериментальные эмбриологи еще в начале нашего столетия убедились, что в ходе органогене­за происходит взаимозависимость развивающихся клеток, тка­ней, частей органов. Эта взаимозависимость, однако, такого рода, что тем или иным клеточным и тканевым компонентам принад­лежит «ведущая» роль. Они, образно говоря, индуцируют раз­витие соседнего клеточного материала (см. гл. XI). Этот факт, имеющий большое принципиальное значение, был установлен Г. Шпеманом и В. Льюисом еще в 1901 г. В. 1904 г. было обна­ружено, что между развитием глазной чаши и развитием линзы существует тесная связь: глазной пузырь индуцирует развитие из прилежащего к нему эктодермального эпителия хрусталика. От глазной чаши, вершина которой контактирует с эпидермисом, как бы исходит какое-то «организующее» влияние — стимул пре­образования клеток эпидермиса в хрусталик. Огромным количе­ством экспериментов большого числа исследователей, в частно­сти советских ученых, было доказано, что любые эпидерм альные клетки при определенных условиях побуждаются к формирова­нию линзы или линзоподобных образований. Доказательства пра­вильности этого положения получены разными эксперименталь­ными способами

Сначала очень широкое отверстие глаза

 

постепенно сильно сужается, но так, что это сужение происходит неодинаково по всей окружности. На вентральном крае глазного бокала отвер­стие остается более открытым. Здесь образуется желобок, дости­гающий глазного стебелька (fissura chrioidea). По желобку в заднюю камеру глаза входят кровеносные сосуды и мезенхим-ные клетки, которые затем и окажутся в стекловидном теле. Впоследствии края сосудистой щели зарастают. У человеческого зародыша это происходит уже на седьмой неделе.

Задняя (большая) часть внутреннего слоя бокала дифференцируется в зрительную часть сетчатки (pars optica retinae), а пе­редняя (меньшая) часть — в радужную и ресничную части. Рес­ничная часть оболочки вместе с прилегающей в этом месте пиг­ментной оболочкой образует концентрические складки, в которые врастает клеточный материал мезодермального происхождения. Так возникает ресничное тело (corpus ciliaris), в котором раз­виваются ресничные мышцы. К ресничному телу с помощью во­локонец— ресничной круговой пленки—прикрепляется хруста­лик. Из радужной части сетчатки при участии сигментной и сосу­дистой оболочек возникает радужная оболочка (iris). Клеточные элементы сетчатки дифференцируются и в нервные волокна, из которых развивается зрительный нерв; он заполняет просвет глаз­ного стебелька. Из клеточного материала мезодермального про­исхождения, врастающего в сосудистую щель глазного стебелька, развиваются кровеносные сосуды, питающие сетчатку.

Глазной бокал не составляет еще глаза. Для нормальной функ­ции зрения должны развиваться добавочные важные структуры. Это прежде всего хрусталик (линза), благодаря которому вхо­дящие в глаз лучи света преломляются. Линза развивается из эктодермального эпителия, который в месте контакта с эктодер­мой наружного участка глазного пузыря утолщается, а клеточ­ные элементы претерпевают специфическую дифференцировку, они становятся призматическими и превращаются впоследствии в хру-сталиковые волокна. Клеточная масса будущего хрусталика от-шнуровывается, превращаясь постепенно по своей структуре и физическим свойствам в хрусталик.

У разных групп позвоночных развитие хрусталика и отде­ление его от эпидермиса варьирует. У птиц и млекопитающих возникают утолщения всего эпидермального слоя (в месте кон­такта с глазным пузырем). Из складывающихся утолщений обра­зуются на короткое время открытые кнаружи карманы; эти утол­щения впоследствии и превращаются в пузырек — формирующую­ся линзу.

РАЗВИТИЕ ГЛАЗА

Развитию органа зрения позвоночных посвящено необозримое ко­личество работ. Глаза амфибий — излюбленный объект в экспе­риментальной эмбриологии. В СССР многочисленные исследова ния проведены Д. П. Филатовым, В. В. Поповым, Т. В. Лопа-шовым, В. А. Голиченковым, Д. В. Поповым,  Г. Г. Квинихидзе и др. Если миновать детали развития этого сложного органа и почти не касаться гистогенетических процессов, изучаемых обыч­но в гистологии, развитие глаза представляется в следующем виде.

Как уже было сказано, первоначальные закладки глаз воз­никают в виде глазных пузырей — выпячиваний стенок промежу­точного мозга (рис. 77,5). Размер глазных пузырей относительно остальной части prosencephalon у разных позвоночных сильно варьирует. Так, по данным Б. И. Балинского (1958), у различ­ных видов лягушек глазные пузыри составляют от 10 до 50 % всего переднего мозга (включая и промежуточный). У костистых рыб, рептилий и птиц возникают зачатки глаз значительно боль­шего размера по сравнению с глазными пузырями амфибий. У зародышей млекопитающих они небольшие. По мере развития глазные пузыри все более обособляются от мозга и остаются соединенными с ним тонкими глазными стебельками.

Увеличиваясь, глазной пузырь приходит в непосредственный контакт с эктодермой и одновременно в нем начинают происхо­дить сложные морфологические изменения. Наружная поверх­ность глазного пузыря уплощается, а затем инвагирует внутрь, так что глазной пузырь превращается в конце концов в двух­слойную чашу — глазной бокал. Инвагинированная стенка бокала значительно толще, чем наружная. Внутренний слой клеток глаз­ного бокала — это закладка сетчатки (retina), наружный слой — закладка пигментной оболочки (stratum pigmenti или tapetum nigrum). Край глазной чаши впоследствии превращается в край зрачка. Полость глазной чаши — это будущая задняя камера глаза, заполняющаяся стекловидным телом, которое развивается из внутреннего листка глазного бокала, т. е. оно эктодермального происхождения. Однако в формировании стекловидного тела при­нимают участие и клеточные элементы мезодермального проис­хождения, врастающие через сосудистую щель.

РАЗВИТИЕ СПИННОГО МОЗГА И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Спинной мозг развивается так, что клетки его стенок, размно­жаясь, дифференцируются в двух направлениях—одни в ней-роглию (поддерживающие клетки), а другие —в нервные. Под­держивающие клетки, располагающиеся вокруг нервного канала и в толще боковых стенок, образуют отростки, которые как бы поддерживают, скрепляют нервные клетки. Клеточные тела нейробластов образуют серое вещество спинного мозга, а нерв­ные волокна и их миелиновые оболочки — белове-вещество.

Часть отростков выходит из спинного мозга. Это — брюшные корешки спинно-мозговых нервов. Вследствие разрастания брюш­ных и спинных частей серого вещества возникают передние и задние рога спинного мозга. В связи с развитием конечностей вместе с отхождением нервов конечностей в спинном мозге раз­виваются шейное и поясничное утолщения. В книге даются лишь общие сведения о развитии периферической нервной системы. Двигательные нервные волокна нервной трубки выходят сег-ментно расположенными пучками и дают начало двигательным корешкам спинно-мозговых нервов. Позднее после образования ганглиозной пластинки дифференцируются в сегментные спинно­мозговые узлы с двумя отростками: одни отростки растут по направлению к спинному мозгу и прорастают в него — это бу­дущие чувствительные корешки спинно-мозговых нервов, другие отростки растут в брюшном направлении и соединяются с во­локнами двигательных корешков в спинно-мозговые нервы. Эти смешанные нервы отделяют от себя задние ветви, которые иннер-вируют спинную мускулатуру двигательными волокнами и кожу спины — чувствительными волокнами. Затем спинно-мозговые нервы продолжаются в виде передних ветвей, иннервирующих брюшную мускулатуру (двигательные нервы) и кожу (чувстви­тельные нервы).

От передних ветвей вырастают висцеральные ветви (с дви­гательными и чувствительными волокнами). Власледствии в кон­цевых частях этих ветвей из нервных клеток закладываются по обеим сторонам нисходящей аорты два ствола симпатической нервной системы.

Развивающиеся головные нервы при описании можно объеди­нить в три группы: 1) чувствующие нервы, из которых упомянем обонятельный, слуховой и глазную ветвь тройничного нерва; 2) двигательные нервы — это нервы глазодвигательных мышц и подъязычный; 3) смешанные нервы, формирующиеся из двига­тельных волокон головного мозга и чувствительных нервных во­локон, так называемых головных узлов, возникающих за счет ганглиозных валиков, образующихся впереди заднего мозгового пузыря. К этой группе нервов относится тройничный и лицевой, языкоглоточный и блуждающий.

Дорсальная часть

нервной трубки вытягивается сильнее, чем вентральная вследствие чего задний конец труб­ки выносится за бластопор. Затем происходит изгибание трубки на некотором расстоянии от бластопора. Вершина образующегося изгиба становится зачатком хвоста (рис. 76). Участок, лежащий между вершиной зачатка хвоста и бластопором, дифференцирует­ся как мышцы хвостовой области.

У разных животных, в зависимости от степени сложности нерв­ной системы, имеются значительные анатомические и гистологиче­ские особенности, а также особенности в топографии различных участков центральной нервной системы позвоночных.

У низших позвоночных, например у акуловых рыб, форма дефинитивного мозга мало отличается от мозга их зародышей. У высших позвоночных, в особенности у человека, развивающийся мозг ранних зародышей по своей морфологии мало отличается от мозга взрослых рыб или амфибий, но дефинитивный мозг, особенно по клеточной и тканевой структуре, резко отличается от мозга низших представителей позвоночных. Прогрессивная эволюция организмов не обязательно сопровождалась усложне­нием в устройстве всех органов. Так, в некотором отношении глаза у птиц или некоторых насекомых более совершенны, чем глаза млекопитающих. Что касается эволюции головного мозга, то у человека он достиг поразительного совершенства, и, грубо говоря, бывший и дальнейший большой прогресс в его струк­туре и функциях не коррелирован со сравнительно медленными и менее радикальными преобразованиями других органов, напри­мер кишечного тракта.

НЕЙРУЛЯЦИЯ. РАЗВИТИЕ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Следующая за гаструляцией стадия в развитии позвоночных — нейруляция. Зародыш на этой стадии называют нейрулой. Мате­риал презумптивной нервной системы у позвоночных животных — это обширный пласт клеток, покрывающий хорду и сомиты. По краям нервной пластинки образуются два нервных, или медул­лярных, валика — утолщения пластов клеток презумптивной нервной системы . Эти утолщения возникают сначала на переднем конце зародыша, а затем постепенно появляются в средней или задней частях его. Впоследствии валики становятся все более высокими, сближаются сначала в срединной части, а затем и в задней; наконец, смыкаются своими гребнями, образуя нервную, или медуллярную, трубку. Эта трубка, развивающаяся в спинной мозг, приблизительно одинакового диаметра на всем протяжении. Передний отдел нервной трубки образуется позд­нее, также путем смыкания валиков, которые, однако, здесь бо­лее высокие, поэтому головной отдел медуллярной трубки ока­зывается более расширенным. Из него развиваются передний и средний мозговые пузыри. В передней части нервной трубки полость ее шире, чем в задней. .

Позднее головной отдел| медуллярной трубки превра­щается в головной мозг. По­лость задней части нервной трубки превращается в канал спинного мозга.

Важно отметить, что часть клеток не включается ни в нервную трубку, ни в эпидермис. Они распо­ложены в виде полоски по всей длине нервной трубки. Образуется нервный гребень, или ганглиозная пластинка. После того как нерв­ная трубка отделяется от эпидермиса, эта полоска располагается между нервной трубкой и покрывающим ее эпителием, но впо­следствии она разделяется на правую и левую половины, которые залегают дорсолатерально по отношению к нервной трубке. Пе­редний участок презумптивного головного мозга довольно долго не закрывается. Отверстие на переднем конце нервной трубки называется нейропором (или невропором). Задний отдел нервной пластинки при замыкании в трубку прикрывает своим сводом бластопор. Он находится теперь на заднем конце дна медулляр­ной трубки и становится нервно-кишечным каналом. (У некото­рых позвоночных, в частности у хвостатых амфибий, нервно-ки­шечный канал не возникает.) В области шеи и туловища нервная трубка дифференцируется в спинной мозг, а передняя часть нервной трубки превращается в головной мозг. Передний уча­сток нервной пластинки у всех позвоночных и в особенности у человека значительно шире, и с самого начала формирования нервной трубки диаметр ее неодинаков в разных участках. Зна­чительно более расширен передний, головной участок, и стенки трубки здесь толще, чем в задней части. Дорсальный и вен­тральный участки стенки медуллярной трубки более тонкие, чем разрастающиеся боковые участки. Канал нервной трубки пре­вращается в центральный спинно-мозговой канал развившегося мозга.

КЛАССИФИКАЦИЯ ОРГАНОВ КАК ПРОИЗВОДНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ ПЛАСТОВ

Органогенез — предмет исследования эмбриологии, гистологии, анатомии, физиологии и других наук, так как он является сово­купностью процессов изменения формы, тканевого строения, воз­никновения и изменения биохимических и физиологических яв­лений и т. д. Эмбриология должна изучать процессы, сопровож­дающие развитие того или иного органа в их совокупности и при разных способах репродукции. Однако это пока идеал, к ко­торому стремятся. На самом деле развитие органов изучается в разных аспектах и подчас очень односторонне, в отрыве морфо­логии от физиологии. Невозможно сообщить в книге необозримое количество данных о развитии всех органов животных. В даль­нейшем будут даны только отдельные примеры. Выбор их не произволен: он диктуется или особой важностью этих органов для жизни организмов, или возможностью на развитии данного органа познакомиться с общими закономерностями формообра­зования, вскрытыми эмбриологией, или, наконец, большей изу­ченностью развития некоторых органов излюбленных эмбриоло­гами объектов. К сожалению, состояние эмбриологии не позво­ляет дать какой бы то ни было сравнительный очерк органогенеза •беспозвоночных и позвоночных животных. Потребности меди­цины и ветеринарии обусловили большее внимание к органоге­незу позвоночных и особенно млекопитающих. Вот почему в книге дается описание органогенеза именно позвоночных животных. При изучении органогенеза надо учесть, что классификация органов по их генезису (производные эктодермы, энтодермы и мезодермы) вполне оправдана эмбриологическими данными и теорией зародышевых пластов в том смысле, что возникновение зачатка (закладки) органа связано с локальными изменениями определенных участков того или иного зародышевого пласта. Однако в большинстве случаев органы позвоночных — производ-•ные двух или всех трех зародышевых пластов (например, яичник, кишечная трубка, орган слуха, нос и т. д.), при этом подчас невозможно выделить какой-либо главенствующий клеточный ма­териал, от которого зависел бы механизм развития органа. По­этому классификация органов на эктодерм альные, энтодерм аль-ные и мезодермальные столь же доступна сомнениям, критике, ограничениям, как и теория зародышевых пластов, на которой эта классификация основана.

Нельзя придавать этой классификации тот смысл, будто кле­точный материал первоначальной закладки органа приобретает какие-то особые гистотипические и «органные» свойства. Это неверно, во-первых, потому, что развитие органа, по крайней мере вначале, не есть автономный процесс, оно происходит при тесней­шем взаимодействии составляющих зачаток клеток и взаимодей­ствии различных зачатков. Во-вторых, при бесполом" размноже­нии и экспериментальном соматическом эмбриогенезе развитие органов той же структуры и с теми же функциями может про­исходить существенно по-иному, в результате иных гистогенети-ческих, анатомических и физиологических процессов.

процессы деления клеток

 

Продполагают, что некото­рые из этих веществ, вырабатываясь уже на ранних стадиях раз­вития, играют роль своеобразных внутриклеточных гормонов, регулирующих процессы деления клеток; затем они приобретаюг функции гормонов, играющих роль в движении клеток, и, наконец, становятся медиаторами нервной системы. Удалось обнаружить. синтез медиаторов на очень ранних стадиях развития. Так, яйце­клетки вьюна синтезируют серотонин уже на 12 мин после опло­дотворения. Синтез ацетилхолина, серотонина и адреналина обна­ружен в яйцеклетках морских ежей, он резко усиливается сразу после оплодотворения, за 1,5—4 ч до первого клеточного деления, и значит, за 10—15 сут до начала формирования нервной системы. (Г. А. Бузников, 1968). Предполагают, что «до нервный» синтез медиаторов — универсальное явление. Эти вещества играют важ­ную роль в регуляции процессов деления клеток.

К изложенным представлениям о значении физических явле­ний и амебоидного движения в морфогенетических процессах Т. Густафсон в 1966—1969 гг. внес существенно новое, именно-в связи с представлениями о медиаторах. Изучая влияние на про­цессы развития морского ежа многих фармакологических веществ, блокирующих нервногуморальную трансмиссию (1968), он обна­ружил функционирование примитивного нейросекреторного меха­низма, в котором большая роль принадлежит серотонину. Благо­даря псевдоподиальной активности на стадии гаструляции из вершины архентерона, а позже из эктодермальных ресничных шнуров мигрируют клетки, которые можно назвать «первичными нейронами»; в них локализованы медиаторы нервной системы. Эти клетки играют роль в нервной трансмиссии и стимулируют морфогенетическое движение, активируя группы эктодермальных клеток. Густафсон предположил, что серотонин служит веществом, обеспечивающим гаструляционные передвижения клеточных плас­тов. Серотонин нейтрализует влияние различных веществ, способ­ных остановить гаструляцию.

Исследования влияния нейрофармакологических веществ не­сомненно интересны.

Почему в результате дробления формируется

 

не компактная масса клеток, а полый шар (бластула)? По Густафсону, это под­дается объяснению в терминах механики и геометрии. Примем во* внимание радиальный план дробления яйца ежа, а также то, что-клетки очень сильно прилипают к гиалиновой мембране, имеющей­ся на наружной поверхности бластулы. Гиалиновый слой (мембрана) достаточно хорошо-изучен. Он может быть отделен'от клеток. Этот слой необходим для развития; гаструляция у морских ежей может блокироваться, если. нарушить целостность гиалинового слоя.

Как видно из схемы, внешний и внутренний объемы бластулы по мере делений клеток по геометрическим причинам должны возра­стать.

Дальнейшие изменения формы, все более локальные, не зави­сят от делений клеток. Например, ко времени инвагинации проис­ходят различные утолщения стенки и ее кривизны. Сферическая^. форма преобразуется так, что становится треугольной. Если кон­такт между клетками будет возрастать, а контакт их с мембра­ной останется константным, то слой клеток будет неизбежно ис­кривляться. Если контакт с мембраной уменьшается, то образу­ется слой столбчатых клеток.

Однако вскоре в развитии зародыша вступают в силу новые-факторы не меньшего значения. Это — «псевдоподиальная актив­ность» клеток, возможность активных перемещений клеток. На стадии поздней бластулы происходит миграция первичных мезен­химных клеток в бластоцель . В области вегетатив» ного полюса связь между клетками и с гиалиновой мембраной-ослабляется, клетки приобретают амебоидную подвижность и про­тискиваются в бластоцель. Это сопровождается энергичными пуль­сациями клеток на их внутренней поверхности (естественно, что на внешней стороне, где они связаны с мембраной, пульсаторные движения исключены). Псевдоподиальная активность первичных мезенхимных клеток усиливается, энергично образуются длинные псевдоподии, которые как бы «выстреливаются» клетками в блас­тоцель . Концы псевдоподий контактируют со стенкой бластулы. Сокращение псевдоподий вызывает «подтягивание», переме­щение клеток. Если же не произошло контакта концов псевдоподий со стенками, то они втяги­ваются в клетку. Клетки рассеиваются в нижней половине бластулы. Т. Гу-стафсон делает предполо­жения об особенностях со­стояния разных участков стенки бластулы, о свое­образии контактов меж­ду клетками и в связи с этим о неодинаковых возможностях слипания концов псевдоподий с разными, клетка­ми. Для понимания образования первичной мезенхимы оказыва­ются ненужными старые представления о хемотаксисе клеток.

Густафсон дает объяснение и процессам инвагинации и обра­зования вторичной мезенхимы. При первой фазе инвагинации от­мечается энергичное «кипение», и «вспузыривание» клеток, подоб­ное тому, что обнаружено и для клеток первичной мезенхимы. Это опять-таки связано с ослаблением контактов между клетками, но связь с гиалиновой мембраной при этом остается. По чисто меха­ническим и геометрическим причинам должна происходить инваги­нация. Если концы пласта фиксированы, клетки имеют тенденцию к округлению и контакт их друг с другом уменьшается, то слой должен изменяться так, как это и происходит в начале инва­гинации. Продвижению пласта способствует «выстреливание» псевдоподий клетками вершины инвагинирующей области. Концы псевдоподий слипаются с клетками эктодермы, и это содействует «подтягиванию» первичной кишки. Клетки на вершине конуса, наконец, теряют связь между собой и с гиалиновой мембраной и внедряются в бластоцель, образуя вторичную мезенхиму. Есть указания на то,- что вещества, связанные с функционированием нервной системы, играют важную роль в морфогенетических про­цессах уже на ранних стадиях развития организмов. Утверждают, что синтез медиаторов нервной системы происходит уже на ран­них стадиях развития зародышей, задолго до возникновения нерв­ной-системы. Медиаторы нервной системы —это низкомолекуляр­ные физиологически активные вещества — ацетилхолин, серотонин, адреналин и др., — благодаря которым осуществляется передача нервных влияний от клетки к клетке.

ГИПОТЕЗА Т. ГУСТАФСОНА

 

Работы Т. Густафсона и его коллег могут служить примером пло­дотворных поисков связи между биохимией и морфологией раз­вития. Густафсон справедливо утверждает, что в эмбриологии

почти нет гипотез и фактических данных о причинных зависимос­тях между биохимическими изменениями (например, в синтезе -нуклеиновых кислот и белков), с одной стороны, и морфологичес­кими изменениями — с другой. Необходимо искать «мосты». В фи­зиологии стандартной практикой является объяснение процессов в терминах физических наук, например объяснение биения сердца и циркуляции крови на основе гидродинамики. В эмбриологии также требуется изучение электрических, гидростатических и иных внутриклеточных и межклеточных сил. Это поможет найти недо­стающие звенья связи между химическими и морфологическими -процессами.

Густафсон пытался объяснить морфологию развития морского •ежа, в частности процессов гаструляции, с использованием в ос­новном двух групп закономерно наблюдаемых явлений: по-первых, степени слипания, степени контактов между клетками и, во-вто­рых, амебоидной подвижности клеток.

Используя метод цейтраферной микрокиносъемки, он изучил такие явления, которые не были известны эмбриологии. В зре­лом, еще не дробящемся яйце имеются три зоны с определенным значением: клетки анимального полушария — это бу­дущая эктодерма (3-я зона): клетки вегетативного полушария — это клетки первичной мезенхимы (1-я зона) и, наконец, клетки, находящиеся между названными зонами, — это энтомезодерма (2-я зона). За первые 10 ч (приблизительно после десятого дроб­ления) образуется сферическая однослойная бластула, состоящая лримерно из 1000 клеток.

В эмбриологической литературе не раз

 

дискутировался воп­рос — являются ли морфогенетические движения, наблюдаемые в ходе гаструляции, функцией зародыша в целом или к моменту перехода от бластулы к гаструле происходит уже такая дифферен-цировка частей зародыша, что эти части способны к автомати­ческим, не зависящим от целого преобразованиям. Однако столь резкое противопоставление целого его частядо и соответственно противопоставление предполагаемых двух групп факторов может быть несколько метафизично и заслуживает внимания лишь в по­рядке рабочей гипотезы, дающей возможность экспериментиро­вать для получения ориентировочных данных.

Эксперименты в таком направлении оказались очень полезны­ми, так как результаты их хотя и не объясняют процессы гастру­ляции, но ставят ряд новых неожиданных проблем, что уже зна­менует прогресс знаний. Если поместить зародыши амфибий в подщелоченную воду (рН 9,6 или 9,8), то они распадаются на не связанные между собой клетки. Масса диссоциированных таким образом клеток приготовлялась из эктодермы, энтодермы и мезо­дермы со стадии гаструлы, из эпидермиса и нервной пластинки со стадии нейрулы и т. п. Массы клеток смешивались в различ­ных комбинациях и помещались в растворы с нормальным для них рН (8,0). Клетки начинали соединяться в агрегаты соответственно их свойствам (рис. 68). Эктодермальные клетки и клетки нервной пластинки со стадии нейрулы оказывались на поверхности комоч­ков, а мезодерм альные клетки и клетки энтодермы, находивши­еся в общей массе с клетками эпидермиса, имели явную тенден­цию расположиться внутри комочков. При комбинации диссоции­рованных клеток всех трех зародышевых пластов эктодерм альные клетки концентрировались на поверхности и мезодермальные клетки оказывались между эктодермальными и энтодермальными клетками.

Эти и подобные им факты следует взять на учет при анализе процессов гаструляции. П. П. Иванов и другие исследователи обращали внимание на то, что на стадии поздней бластулы ам­фибий клетки в разных частях зародыша неодинаковы по своим физиологическим потребностям: эктодермальные клетки «требу­ют» „одних условий, а клетки, омываемые внутренней средой—• жидкостью бластоцеля, проявляют свою физиологическую актив­ность при иной среде.

Каковы бы ни были физико-химические особенности- клеток, побуждающие их к определенным типам взаимосвязи (будь то особенности клеточных мембран, своеобразие слипания клеток или иммунохимические свойства типа антиген — антитело), эти особенности несомненно играют роль в морфогенетических движе­ниях клеток и клеточных масс. В дальнейшем эти вопросы будут дополнительно рассмотрены в гл. XV.

Поведение клеточных элементов и частей эмбриона не авто­номно: 1) намечающаяся клеточная дифференцировка в разных частях зародыша есть результат развития зародыша в целом; 2) в дальнейшем развитии поведение зародышевых пластов и разных участков зародыша, как увидим в гл. XI, определяется не только приобретенными морфогенетическими потенциями частей, но и взаимным влиянием частей. К тому же не следует переоценивать результаты указанных опытов, так как в лучшем случае их ре­зультаты лишь отдаленно напоминают действительные процессы нормального развития — формирование соответствующих пластов клеток, полостей и т. д. В гл. XI о детерминации будут сообщены многие факты якобы независимого развития частей зародыша в условиях эксплантации и дан анализ этих фактов.

Одной из биологических особенностей клеток

 

является их способность к амебоидным движениям и фагоцитозу. Эти две черты — отражение древнейших свойств клеточных существ. Б. П. Токин в 1955 г. в связи с проблемой иммунитета зародышей предполагал, что следует придавать значение важному обстоя­тельству: потенциально всем жизнедеятельным клеткам любых тканей, принадлежащих организмам любой степени сложности, свойственны фагоцитарная способность и амебоидная подвиж­ность (см. гл. XV). Эта способность находится под «арестом» ин­теграции тканей благодаря взаимным влияниям клеток и, веро­ятно, еще неизвестным факторам биологической и физико-хими­ческой природы. Взаимное влияние клеток имеется уже на са­мых ранних стадиях развития зародыша в эпителиального типа пластах, как и в любом скоплении клеток. В случае нарушения состояния интеграции и освобождения их от обычных корреляций клетки начинают проявлять способность к амебоидному движению и к фагоцитарным реакциям.

Впервые Гольтфретером показано, что если зародыши амфибий на стадии бластулы, гаструлы или нейрулы дезинтегрировать (до­биться химическими способами диссоциации зародыша на отдельные клетки и группы их), то проявляется фагоцитарная актив­ность одиночных клеток.

Таким образом, способность клеток зародыша к амебоидной подвижности является прочно установленным экспериментами фактом. Это помогает объяснять поведение одиночных клеток и их групп, наблюдаемое в ходе гаструляции, происходящей по типу униполярной и мультиполярной иммиграции. Одним из моментов морфогенетических движений при гаструляции у морского ежа яв­ляется активное перемещение клеток внутрь бластоцеля. Несом­ненно, и при смешанных типах гаструляции, например у амфибий, способность к амебоидным движениям клеток играет важную роль. Несколько искусственно сближать явления фагоцитоза с про­цессами обволакивания анимальными бластомерами вегетатив­ных, наблюдающихся при гаструляции, которая происходит по типу эпиболии, хотя не исключена возможность того, что эти процессы имеют общую морфофизиологическую основу в жизни клеток.

электронно-микроскопические снимки заро­дышей амфибий

Эти мысли очень подкупают своей ясностью. Однако Б. Балин-ский в 1961 г., изучая электронно-микроскопические снимки заро­дышей амфибий, не обнаружил ни coat, ни вообще каких-либо мембран, помимо известных оболочек яйца амфибий. Грустно от­казываться от оригинальной гипотезы Гольтфретера. Может быть, в этом нет надобности, так как и Балинский утверждает, что ди­стальные концы клеток очень прочно соединены между собой бла­годаря каким-то «цементирующим» субстанциям, являющимся экскрецией самих клеток. Координирующим механизмом морфо-генетических движении могут быть, вероятно, и другие клеточные структуры, например нитевидные отростки клеток. Таким обра­зом, их поведение в районе дорсальной губы бластопора можно объяснить исходя из предположений Гольтфретера, но заменив слишком прямолинейные представления о coat как пленке и о ме­ханизме движения более физиологической теорией.

Для анализа процессов гаструляции, как и других морфо-генетических движений клеток и клеточных масс, следует все больше привлекать многочисленные цитологические данные о раз­ных типах связей между клетками, обнаруживаемых химически­ми и электронно-микроскопическими исследованиями. Одним из инициаторов изучения взаимодействия между клетками является английский исследователь М. Эберкромби, а также Дж. Картис.

Характер сцепления между клетками, разная степень слипа­ния, структура межклеточных пространств и другие факторы игра­ют, по-видимому, огромную роль во всех явлениях формообразо­вания, в том числе и в процессах гаструляции. Связи между клетками могут быть разнообразными: выросты мембран клеток, выпускание псевдоподий, ундулирующие мембраны (пластинча­тые выросты, способные волнообразно колебаться) и т. п.

Между клетками даже таких плотных тканей, как эпителии, никогда не бывает полного контакта, всегда существует между их мембранами пространство (60 нм и более). Большие простран­ства между клетками (до долей мк) наблюдаются в мезенхим-ных тканях. Пространства между клетками — не пустота, они за­полнены веществами — продуктами жизнедеятельности клеток. Старые представления о клетках как стабильных кирпичиках и тканях как стабильных сооружениях из иих следует целиком оставить. Клетки могут скользить своими поверхностями, они никогда не бывают в покое, если они живы, и стабильность сооружений — тканей и органов — объясняется не тем, что клетки находятся в мертвом, неподвижном состоянии, а иными надкле-точными закономерностями. В этом отношении возможна анало­гия архитектоники живых существ с физическим состоянием твер­дых тел, «твердость» которых отнюдь не объясняется неподвиж­ностью молекул. Последние находятся всегда в движении. Но архитектоника пластов клеток может сильно меняться при нор­мальных процессах формообразования, и клетки, освобожденные из общих связей, могут проявлять скрытые до того потенции.

ПРАВИЛА О. ГЕРТВИГА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

К АНАЛИЗУ РАЗВИТИЯ АМФИБИЙ, РЫБ, ПТИЦ И НАСЕКОМЫХ

Уже упоминалось о большом значении, которое придает эмбрио­логия правилам О. Гертвига для понимания причин разных типов дробления яиц.

Первое правило Гертвига: ядро занимает центр активной протоплазмы (полностью или почти полностью свободной от желтка). В алецитальных и изолецитальных яйцах ядро располо­жено ближе к центру а у телолецитальных оно рас­полагается эксцентрично, в анимальном полушарии.

Второе правило Гертвига: веретено деления ядра располага­ется в направлении наибольшей протяженности чистой протоплаз­мы

Ярким примером правильности этих утверждений служит характер дробления телолецитальных яиц амфибий. Ядро у них, как уже сказано, расположено в анимальном полушарии. Наи­большая протяженность чистой протоплазмы параллельно эквато­риальной плоскости . В этом направлении и окажется веретено первого деления ядра. Кариокинетический процесс связан с передвижением различных составных частей клетки, ее хромосом, частей цитоплазмы, корти­кального слоя. Классическая описатель­ная гистология и цитология, так много давшие биологии с - их методиками фиксации и окрашивания клеток, при­вивают, однако, изучающему клетки, тка­ни и развитие организма совершенно не соответствующее действительности представление о клетках, как о чем-то неподвижном. Мы неоднократно будем убеждаться в том, что такое представле­ние о клетках необоснованно.

Различного рода закономерным дви­жениям составных частей ядра и цитоплазмы могут мешать зерна и пластинки желтка. Если желток. расположен очень компактно, то процесс дробления в определен­ном участке яйца может подавляться.

Первая борозда дробления у яиц амфибий определяется ука­занным направлением веретена деления ядра (параллельно эква­ториальной плоскости, иначе — перпендикулярно к анимально-вегетативной оси яйца). Поэтому дробление произойдет в плоскости одного из меридианов яйца

Близкие к этому представлению мысли высказал

 

в 1941 г. А. Р. Мур в связи с анализом формы клеток при нейруляции

  Предполагают, что неодинаковая интенсивность поглощения воды различными клетками поздней бластулы может быть причи­ной морфогенетических движений. Наблюдения показывают, од­нако, что эти различия невелики.

  Предполагают, что во внутренней цитоплазме клеток форми­руются параллельно расположенные волоконца, в связи с чем: клетки удлиняются, а это имеет значение при впячивании энто­дермы при гаструляции. Действительно, при гаструляции, напри­мер амфибий, инвагинирующие клетки оказываются длинными,. бутылкообразными. Однако неизвестно еще, почему клет­ки удлиняются и почему они принимают бутылковидную форму. Это явление, кажущееся причиной, нуждается в цитологическом и физико-химическом объяснении.

  Интересную гипотезу предложил И. Гольтфретер в 1943— 1944 г. для объяснения причин «втягивания» клеток в районе дорсальной губы бластопора при гаструляции у амфибий. Соглас^ но его наблюдениям у яиц амфибий, помимо студенистой и жел­точной оболочек, имеется еще тончайшая пленка, видимая в све­товой микроскоп, если на пленке адсорбируется краситель. Пленка эта — coat (от англ. coat,— одежда) покрывает клетки анимального полушария . Таким образом, дистальные концы клеток как бы прикреплены к coat, а большая, проксимальная часть клеток свободна от нее. В результате большой комплекс клеток как бы связан. Эластичная, растяжимая пленка — основ­ная структура, соединяющая поверхностно лежащие клетки в еди­ное целое и поддерживающая совокупность клеток, как «спаян­ную» массу.

При гаструляции отмечаются энергичные амебообразные дви­жения клеток в области дорсальной губы бластопора, но изолиро­ванными эти движения быть не могут, так как дистальные концы всех клеток связаны с их общей «одеждой». Сила натяжения и сократимость пленки противодействуют амебоидному движению и зависящему от него впячиванию клеток. Если клетка не отде­ляется от coat, то она, вытягиваясь, превращается в бутылкооб­разную  и даже нитевидную. Пленка заставляет клет­ки вести коллективный образ жизни. Как слагаемое их совмест­ных действий, при регулируемом влиянии coat происходит неиз­бежное впячивание групп клеток внутрь.

Логично предположение Гольтфретера и о том, что некоторые участки coat в ходе гаструляции окажутся внутри зародыша, coat будет препятствовать слипанию клеток и тем самым играть фор­мообразовательную роль при развитии просвета кишечника, нерв­ной трубки и почечных канальцев.

Агенты, уменьшающие силу натяжения поверхностной пленки или совершенно удаляющие ее (лишение Са, растворы с рН выше 9,6 или ниже 4,4 и др.), обусловливают экзогаструляцию. Так, по данным Гольтфретера, лимоннокислый натрий растворяет coat у амфибий, и происходит экзогаструляция.

ПРИЧИНЫ ГАСТРУЛЯЦИИ

Тщетно искать одни и те же причины морфогенетических движе­ний ' при гаструляциях разного типа, например при образовании деляминационной и инвагинационной гаструл. Однако не исклю­чено наличие и общих черт у кажущихся совершенно различных явлений.

Имеются исследования процессов гаструляции, осуществленные многими авторами. К сожалению, за единичными исключениями, все исследования проведены в основном на двух объектах — яйцах морских ежей и, в меньшей мере, на зародышах амфибий. Это означает, что экспериментальная эмбриология далеко не исчер­пала разнообразие явлений гаструляции при разных ее типах и •еще не в состоянии формулировать общие закономерности. По этой причине можно дать лишь иллюстрации подчас довольно про­тиворечивых фактов и гипотез, касающихся гаструляции.

1.   Причиной гаструляции некоторые эмбриологи считают не­равномерный рост в разных областях зародыша, точнее—неоди­наковые темпы деления клеток в разных частях зародыша. В слу­чае типичной эпиболической гаструлы, вероятно, следует прини­мать во внимание эту гипотезу, так как одной из причин обраста­ния анимальными бластомерами вегетативных несомненно явля­ется факт сильно замедленных темпов деления вегетативных блас-томеров. Также и при анализе механизма смешанных типов гаст­руляции, например у амфибий, одним из факторов гаструляции является, вероятно, неравномерный «рост». Однако эта давняя в эмбриологии гипотеза совершенно бессильна объяснить многие явления. Например, может и не быть делений клеток, а процессы гаструляции происходят. Из-за этого не следует вообще отказы­ваться от мысли о значении митотического градиента во время гаструляции, иллюстрацией чему служат наблюдения И. Агреля митотического градиента у зародыша морского ежа (Psammechi-nus tniliaris) 8—22-часового возраста (подсчитывались митозы в эктодерме, первичной мезенхиме, энтодерме и во вторичной ме­зенхиме) .

У 10-часовых зародышей обнаружено уменьшение числа мито­зов по направлению от анимального полюса бластулы к ве­гетативному. Через новые 3 ч в экваториальной области зародыша митозов оказывается меньше, чем у полюсов. Это распределение со­храняется до конца гаструляции. Автор считает, что инвагинация (энтодермальное впячивание) связана с локальным усилением митотической активности в области бластопора. Образование же первичной и вторичной мезенхимы зависит не от размножения клеток, а от миграции их.

2.  Л. Румблер в 1902 г. предложил объяснить гаструляцик? чисто механическим путем: клетки впячивающейся части изменя­ют форму, становятся «клиновидными», обращенные в полость бластулы концы клетки становятся более широкими, а концы, об­ращенные к внешней среде, суживаются. Вследствие этого и в ре­зультате давлений клеток друг на друга происходит втягивание данного участка пласта клегок внутрь. Изменение формы клеток обусловлено разницей в поверхностном натяжении с той и другой; стороны клеток.

Детекторы

При анализе микропримесей работают с селективными детекторами, чувствитель­ными к интересующему веществу. Предельная чувствительность детектора зависит от отношения сигнала к шуму самого детектора и от его способности реагировать на микропримеси в образце. Перед выполнением анализа необходимо эти микропримеси идентифицировать. Наиболее часто при анализе микропримесей применяют высокочувствительные фотометрические детекторы, работающие в УФ-области, и

спектрофотометры. УФ-фотометры, имеющие чувствительность более 0,002 е.о.п. на всю шкалу при шуме 1%, позволяют обнаруживать нанограммовые количества веществ, умеренно поглощающих в УФ-области, а флуориметры — даже пикограммовые. Для достижения максимальной чувствительности желательно работать при длине волны, соответствующей максимуму поглощения в УФ-спектре вещества. Получение со­ответствующих производных после колонки повышает селективность анализа и позволяет проводить его при максимальной предварительной очистке образца.

Примеси, способные к окислению или восстановлению в электролите, наиболее целесообразно определять чувствительными электрохимическими детекторами.

Калибровочные графики

При количественном анализе микропримесей не так важна высокая точность измерений, как их надежность, что достигается получением зон, свободных от посторонних соединений. Так как точность около 10% считается вполне удовлетворитель­ной, пики можно оценивать по их высоте, меньше зависящей от четкости отделения микропримеси от соседних зон, пики которых могут накладываться на пики анализируемых микропримесей. Хотя оценка по площадям пиков более точна, калибров­ка по высоте пиков удобнее.

В ВЭЖХ калибровочные графики микропримесей обычно линейны и проходят через начало координат. Чтобы избежать возможных частичных потерь образца, проводят калибровку методом внутреннего стандарта (по соотношению высот пиков), причем внутренний стандарт известной концентрации добавляют до предварительной обработки образца. В этом случае потери учитывают за счет эквивалентного изменения концентрации внутреннего стандарта и образца. Стандартный образец, близкий по свойствам микропримеси, добавляют, когда трудно выделить анализируемое вещество в чистом виде, чтобы построить калибровочный график. Подробнее калибровка по методу внутреннего стандарта рассмотрена в гл. 10.

При анализе сложных смесей, в частности в тех случаях, когда наблюдаются эффекты влияния матрицы или когда получение в чистом виде исходного образца, для которого строится калибровочный график, затруднительно, применяют метод добавления стандарта. Наличие других компонентов в образце может влиять на степень удерживания и (или) высоту пика интересующего вещества. Метод добавления стандарта состоит в следующем. Образец разделяют в хроматографе и измеряют высоту h_x интересующего нас пика. После этого добавляют известное весовое количество W_x вещества X и повторяют разделение, определяя высоту пика h'_x вещества X. Для вещества X строят калибровочный график и, определив калибровочный коэффициент Sx=(h'_x—h_x)/W_x, вычисляют количество вещества X в исходном образце как hJS_x. Для проверки ли­нейности графика берут несколько значений W_x. Метод добавления стандарта не обеспечивает поправки на нестабильность базовой линии, на помехи со стороны других компонентов и т.д. Эти помехи должны быть выявлены до добавления стандарта.

Методом, альтернативным методу добавления стандарта, является получение образца без анализируемого вещества и использование этого образца как матрицы для подготовки стандартов при обычной калибровке.

При определении микропримесей нужно придерживаться следующих рекомендаций.

1.   Проводить предварительное концентрирование образца, а в ряде случаев и предварительную его очистку.

2. Использовать большие объемы образца и короткие эффективные колонки, заполненные частицами сорбента менее 10 мкм, особенно микроколонки.

3.  Применять наиболее чувствительные детекторы с высоким отношением сигнала к шуму.

4. Применять хроматографические системы, обеспечивающие высокую разрешающую способность для микропримесей (ос>1,2) при относительно низких значениях к' (0,5—1,5).

Если это возможно, то разделение следует проводить в обращенно-фазном варианте, когда основной компонент выходит в зоне to. 5. Калибровку проводить по высоте пиков.

Разрешающая способность колонки

Иногда удается провести разделение на обращенной фазе таким образом, что основные компоненты образца элюируются со временем, близким к to, а микропримеси удерживаются на колонке, что облегчает их количественное определение. Оценка содержания микропримеси наиболее надежна, когда ее пик регистрируется до пика преобладающего в образце компонента. Элюирование пика микропримеси на хвосте преобладающего компонента сильно ухудшает ее количественное определение. Любое хроматографическое разделение на колонке приводит к разбавлению образца. При анализе микропримесей возникает проблема разделения при минимальном разбавлении. Степень разбавления введенного образца может быть выражена уравнением

С макс/Со = VsN°'⁵/[Vr(27i)⁰'⁵],

где Смакс — Концентрация, соответствующая максимуму пика; Со — исходная концентрация в образце; Vs — вводимый объем; N — число теоретических тарелок для данной колонки; Vr — удерживаемый объем микропримеси.

Из уравнения видно, что снижения степени разбавления, .а значит, увеличения чувствительности определения микропримеси можно достигнуть за счет увеличения вводимого объема, использования колонки с большим числом теоретических тарелок или за счет снижения объема удерживания микропримеси. К увеличению N ведет применение эффективных колонок, заполненных частицами с размером менее 10 мкм. При анализе микропримесей желательно применение коротких колонок (5—10 см) с размером частиц 3—5 мкм.

Большое влияние при анализе микропримесей оказывает изменение селективности системы и повышение коэффициента разделения а, что достигается изменением состава подвижной фазы и выбором оптимального хроматографического режима. Кроме того, как видно из уравнения

Смакс/Со =(0С—1 )/0С

изменение селективности может значительно снизить степень разбавления пика.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОПРИМЕСЕЙ

ВЭЖХ является надежным методом анализа микропримесей—веществ с концентрацией 0,01 %.

В жидкостной хроматографии применяют селективные детекторы (амперо-метрический, флуориметрический и др.), способные детектировать очень малое количество вещества. Очистка образца до ввода в жидкостной хроматограф минимальна, Циередко его вводят без предварительной обработки, и без получения производных, что часто невозможно при применении других методов анализа. Наконец, в жидкостной хроматографии возможно создание уникального диапазона селективных взаимодействий за счет изменения подвижной фазы, что значительно улучшает разрешающую способность всей хроматографической системы. Работа с микропримесями налагает ряд требований на весь процесс разделения. Особенное значение имеет разрешающая способность колонки, выбор детектора, предварительная обработка образца и построение калибровочного графика. Правильный выбор условий хроматографирования позволяет повысить чувствительность, надежность и воспроизводимость результатов, что очень актуально при работе с микропримесями.

Предварительная подготовка образца и его ввод в хроматограф

Перед анализом микропримесей для повышения чувствительности желательно провести концентрирование соединения методами, описанными в соответствующем разделе. Предпочтительно применять оборудование, позволяющее проводить автоматическую предварительную обработку образца, в том числе экстрагирование, измельчение, фильтрацию и автоматический ввод в хроматограф.

Для получения высокой чувствительности нужно вводить максимально возможный объем образца. При работе в изократическом режиме на высокоэффективных аналитических колонках оптимальный объем образца составляет от 100 до 500 мкл. Ввод большого объема разбавленного образца позволяет компенсировать относительно низкую чувствительность некоторых детекторов для жидкостной хроматографии.

При небольших количествах образца анализ проводят на колонках с внутренним диаметром 1—2 мм, что уменьшает его расход. Используя в качестве растворителя пробы слабый растворитель, можно наносить на колонку большие объемы образца. При этом он накапливается на входе в колонку, так как к' для компонентов образца велико и в колонке происходит концентрирование микропримесей, что значительно повышает чув­ствительность обнаружения. Пользуясь этим приемом, можно обнаружить некоторые малополярные органические соединения, например ароматические углеводороды, присутствующие в виде микропримесей в сточных водах, на колонке с обращенной фазой.

Для обеспечения наибольшего концентрирования растворитель пробы должен быть по возможности слабым, например, содержать 90—95% воды. В дальнейшем для элюирования пробы силу подвижной фазы резко увеличивают. Концентрирование на

колонке позволяет в некоторых случаях вводить 1 л и более образца при конечном объеме зоны интересующего нас вещества менее 50 мкл (градиентное элюирование), т.е. концентрировать вещество в 20 000 раз. Можно повысить чувствительность обнаружения, проводя концентрирование образца и вне колонки, например, выпаривая растворитель. Однако надо быть уверенным, что при этом не происходит потеря или видоизменение примесей. Кроме того, при таком процессе значительно повысится содержание основных компонентов в образце, что приведет к перегрузке по ним колонки и затруднит анализ. Вещества, удерживаемые сильнее, чем примеси, могут быть после анализа, удалены из колонки не только за счет повышения силы растворителя, но и путем обратной промывки колонки.

Лигандообменная хроматография

 

с успехом применяют для производства оптически чистых меченных тритием аминокислот.

Весьма важное применение лигандообменной хроматографии — быстрое разде­ление асимметрических энантиомеров без предварительного отделения от сопут­ствующих примесей. В лигандообменной жидкостной хроматографии в отличие от лигандообменной газовой хроматографии не требуется предварительное превращение энантиомеров в легколетучие соединения. Обычно в качестве сорбента применяют полистирол, к которому привит радикал оптически активного бензилзамещенного пропилендиамина.

Для сокращения времени анализа, повышения его чувствительности и точности требуется повышение эффективности колонки, что достигается за счет уменьшения частиц полистирольного сорбента. Перспективным является получение сорбентов для лигандообменной хроматографии на основе пористых силикагелей, химически модифицированных активными лигандами. Поверхность силикагеля связывается через п-пропиленовые мостики с L-оксипролиновыми лигандами.

В настоящее время создано и испытано около десятка асимметрических силикагелевых сорбентов. Хотя в большинстве сорбентов использованы оптические изомеры пролина и оксипролина, они различаются сродством к различным аминокис­лотам и порядком их элюирования; это связано с тем, что подвижный лиганд фиксируется в комплексе не только координацией карбоксильной и аминогруппой с ионом меди, но и взаимодействием бокового радикала аминокислоты с ближайшим окружением координационного центра, что определяет в конечном итоге порядок удерживания антиподов аминокислот сорбенте.

Поскольку сорбенты для лигандообменной хроматографии выпускаются, предложены некоторые модификации метода, позволяющие использовать традиционные сорбенты. Так, N-алкилированные оптически активные аминокислоты сорбируются на обращенно-фазном силикагеле. В алкильном радикале должно быть больше 5—6 углеродных атомов. В этом случае модификатор прочно удерживается на сорбенте и не смывается водным элюентом, в который добавляют следовые количества меди.

ЛИГАНДООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Лигандообменная хроматография основана на образовании координационных связей между сорбентом и разделяемыми ионами или молекулами. Лигандообменная хроматография применима только для разделения соединений, содержащих донорные гетероатомы или кратные связи. Ионы переходных металлов, находящиеся в неподвиж­ной фазе, являются акцепторами электронов и легко вступают в координационное взаимодействие с электронодонорными атомами функциональных групп разделяемого соединения. Для проведения лигандного разделения необходимо наличие склонных к координации органических соединений и комплексообразующего катиона металла. Такое разделение характеризуется обратимостью процесса и высокой скоростью обмена лигандов. Лигандный обмен применяют в жидкостной колоночной, тонкослойной и газовой хроматографии, но наибольшие успехи были достигнуты в ВЭЖХ.

Лигандообменную хроматографию применяют для разделения в водной среде соединений, представляющих большой интерес для органической химии и биохимии: аминов, аминокислот, белков, нуклеотидов, пептидов, углеводов. При этом в вчестве комплексообразующих используют ионы меди, цинка, кадмия, никеля, серебра и железа. Ионы ртути и серебра в неполярной среде алифатических углеводородов образуют ла­бильные комплексы с ненасыщенными и ароматическими углеводородами. Большими достоинствами лигандообменной хроматографии является ее селективность и отсутствие жестких требований к сорбенту, который может быть прочно связан ионами металла или только пропитан солями металла.

Аминокислоты занимают две координационные позиции, т.е. являются бидентатными лигандами, что резко повышает прочность их связывания за счет обра­зования хелатного комплекса.

Лигандообменная хроматография оптически активных соединений основана на образовании лабильных координационных соединений, в которых с центральным ионом металла-комлексообразователя одновременно координирована молекула расщепля­ющего асимметрического реагента и один из подлежащих разделению энантиомеров. Для осуществления лигандообменной хроматографии необходимо наличие в расщепляющих реагентах и в разделяемых лигандах донорных гетероатомов серы, кислорода, азота, способных координироваться с ионом металла. Наблюдается хорошая координация ос-аминокислот и ионов меди, цинка и никеля. Донорные атомы образуют плотно упакованную координационную сферу вокруг центрального иона металла, при этом разделяемые лиганды вступают в тесный контакт с расщепляющим реагентом. Этим и объясняется высокая эффективность распознавания реагента, т.е. энантиоселективность.

Такой принцип расщепления рацематов—лигандообменная хроматография— впервые был применен с использованием полистирольного сорбента, ковалентно связанного с остатками оптически активной природной аминокислоты L-пролина. Сорбент прочно координировал двухвалентную медь, оставляя в ее основной координационной плоскости две вакантные позиции для связывания подвижного лиганда молекулы L- или D-аминокислоты. Оказалось, что остаток L-пролина проявляет настолько высокое сродство к D-изомерам аминокислот, что последние пришлось даже вымывать из колонки раствором аммиака, который, координируясь с ионами меди, вытеснял подвижный лиганд из сорбционного комплекса, в то время как L-изомеры десорбировались водой.

Взаимодействием аминогруппы оптически активной аминокислоты с хлорметиль-ной группой полистирола в присутствии иодида натрия синтезировано более 50 сорбен­тов, имеющих асимметрические атомы. Оказалось, что циклические аминокислоты пролин и оксипролин обладают максимальной энантиоселективностью и количественно расщепляют рацематы практически всех аминокислот, а также многие оксикислоты,

диамины, аминоспирты. Достоинством пол исти рольных асимметрических сорбентов являются высокая химическая стабильность, большая обменная емкость и возможность препаративного расщепления рацематов. Иногда за один цикл на 300 г сорбента удается расщепить до 20 г рацемата. Появились лиган-дообменники с привитыми к сили-кагелю аминопропильным или полученным из него дитиокарбаматным радикалом.

Воспроизводимость колонок в ион-парной хроматографии

Такой способ разделения, по-видимому, пригоден для анализа очень полярных молекул, например сульфированных красителей. Длина углеродной цепи неподвижной фазы также варьируется в ион-парной хроматографии.

Воспроизводимость колонок в ион-парной хроматографии удовлетворительная в отличие от таковой в ионообменной хроматографии.

Ион-парную хроматографию обычно применяют для анализа физиологических и биологических жидкостей, полярных соединений и веществ с несколькими ионизи­руемыми группами, в том числе промежуточных продуктов красителей. Расфасованные реагенты для ион-парной хроматографии, состоящие из буфера и противоиона, которые можно непосредственно добавлять в подвижную фазу, выпускает фирма «Уотерс». К ним относится реактив А (0,005 М раствор тетрабутиламмонийфосфата, рН=7,5), реактив В-5 (0,005 М раствор пентансульфокислоты, рН=3,5) и реактив В-7 (0,005 М раствор гептансульфокислоты, рН=3,5).

При отсутствии четких литературных аналогий начинают разделение методом ион-парной хроматографии на обращенной фазе Ci8 с размером частиц 5—10 мкм. Наполнителем в ион-арной хроматографии с добавкой органической неподвижной азы является материал, используемый для обращенной фазы, при работе с нормальной фазой применяют обычный силикагель 5—10 мкм, как и в случае адсорбционной хроматографии, возможно применение нейтральных полистирол-дивинильных смол или смол ХАД. Колонки с Cie служат дольше в ион-парной хроматографии, чем колонки с неподвижной фазой, имеющей более короткую углеводородную цепь. Последующая после «привязывания» фазы силанизация улучшает свойства материала и увеличивает срок его службы (партисил 5 ОДС).

Для увеличения стабильности колонки рН следует уменьшать по мере увеличения концентрации противоиона.

Для этой же цели предложено использовать триэтиламин в качестве основания, так как этот реактив доступен, растворим, удобен в работе и обладает малой химической актив-ностью. Предполагается, что сильные основания, так же как четвертичные гидроксиды, разрушают силикагелевую подложку. Подвижную фазу для ион-парной хроматографии желательно фильтровать через фильтр из стекловолокна, а после окончания работы колонку следует промывать пятикратным объемом элюента метанол — вода (50 : 50).

Необходимо, чтобы противоион растворялся в элюенте. Неправильный выбор противоиона может привести к образованию осадка, что вызовет возрастание значений к', размывание пика и заметное повышение давления на входе. Концентрация обычно колеблется от 0,01 М для противоиона с малой длиной цепи до 0,005 М для противоиона с более длинной цепью.

Для препаративных разделений ион-парную хроматографию не применяют, а количество вводимого образца сопоставимо с количествами, применяемыми для рас­пределительной хроматографии. Увеличение максимально вводимого количества может быть достигнуто за счет предварительного образования ионных пар в образце. Для некоторых ионизированных (независимо от рН) анионов и катионов не требуется добавка буфера. Кислоты обычно разделяются при рН=4—7,4, а основания — при рН=2—5. При этом значения рН подвижной фазы могут для улучшения селективности разделения варьироваться.

Следует помнить, что ион-парная хроматография на обращенной фазе в целом метод более грубый, чем разделение на обращенной фазе, и должен использоваться, когда неприменимы распределительная хроматография на обращенной фазе или метод подавления ионов.

Оптимальными при ион-парном разделении

Оптимальными при ион-парном разделении на обращенной фазе являются средние значения рН. При снижении рН подвижной фазы анионы Х- начинают превращаться в неионизированные кислоты и число ионных пар образца в неподвижной фазе уменьшается, а следовательно, снижается и значение к'. Изменение рН оказывается мощным средством изменения селективности разделения. При высоких значениях рН значение к' также падает, что аналогично уменьшению обменной емкости, так как ионы ОН- подвижной фазы начинают связывать противоионы и конкурировать с анионом образца в образовании ионных пар. Слабые кислоты или основания обычно не используют в качестве противоионов для ион-парной хроматографии.

При ион-парном разделении на нормальной фазе зависимость к' от рН обратна. Компоненты образца более сильно удерживаются при низких и при высоких значениях рН при условии, что неионизированные ионы образца не удерживаются водной фазой. Объем вводимого в ион-парной хроматографии вещества обычно не должен быть очень большим, чтобы не было размывания зон. Иногда ограничивающим фактором является

концентрация противоиона в подвижной фазе; повышая его концентрацию, можно увели­чить максимальную концентрацию вводимого вещества. При повышении концентрации противоиона и соответственном изменении значений к' образца возможно одновременное добавление избытка нейтральной соли в водную фазу, что стабилизирует значение к'. Получаем закономерность, аналогичную закономерности влияния буфер­ного раствора. Максимальное количество вводимого образца может быть повышено при добавлении образца в виде ионных пар. При этом до введения в хроматограф противоион смешивают с образцом, а рН доводят до нужного значения.

Влияние температуры имеет в ион-парной хроматографии большое значение. При использовании механически удерживаемых неподвижных фаз колонка должна быть термостатирована. В ион-парной хроматографии применяют обычно фазы с повышенной вязкостью, а повышение температуры снижает ее. Зависимость селективности от температуры также наиболее выражена в ион-парной хроматографии.

Применяя противоионы, поглощающие в УФ-области, можно получать при ион-парном разделении легко обнаруживаемые спектрофотометром ионные комплексы. Требуется, однако, чтобы противоионы не растворялись в органической фазе во из­бежание высокого поглощения выходящего из колонки раствора. Таким образом, используя ион пикрата или 2-нафтилсульфоната, можно обнаружить амины.

Одним из затруднений, наиболее часто встречающихся в ион-парной хроматографии, является нестабильность колонок, особенно в обращенно-фазном режиме. В колонках с обычной фазой наблюдается постепенный унос противоиона из неподвижной фазы, однако этого можно избежать, получая ионные пары до введения образца в хроматограф. Большим недостатком ион-парной хроматографии является образование хвостов. Причиной этого является либо диссоциация ионных пар, которая уменьшается при повышении концентрации противоиона, либо неправильная концен­трация буферного раствора. Иногда удается уменьшить затягивание зон и увеличить эффективность разделения, перейдя от обычной ион-парной хроматографии к хроматографии с использованием поверхностно-активных веществ.

Способность различных анионов экстрагировать ион

 

Способность различных анионов экстрагировать ион тетра-бутлламмония из воды в хлороформ является мерой эффективности этих противоионов

В тех случаях, когда вещество полностью ионизировано, изменение силы растворителя за счет изменения концентрации противоиона не влияет на селективность, и только когда вещество частично ионизировано или не ионизировано, селективность меняется при изменении концентрации противоиона.

В ион-парном разделении на обращенной фазе сила растворителя меняется за счет изменения полярности подвижной фазы. Увеличивая в смесях воды с метанолом или ацетонитри-лом содержание воды, мы увеличиваем силу растворителя и снижаем значение к' для образца. В ион-парной хроматографии в качестве подвижных фаз применяют бутанол, пентанол, метиленхлорид и гексан. При этом более полярные растворители являются более сильными и дают самые низкие значения к". Сила растворителя в ион-парной хроматографии зависит от его способности стабилизировать или растворять ионы и ионные пары, в отличие от фактора полярности растворителя Р', связанного с его способностью растворять полярные неионные вещества. Сила растворителя в ион-парной хроматографии зависит от параметра Р" и от его диэлектрической проницаемости е. Показателем относительной силы растворителя служит функция Р'+0,25 8

Повышение ионной силы водной фазы приводит к уменьшению числа образующихся ионных пар из-за конкуренции буферных ионов с противоионом за образование ионной пары. Поэтому повышение ионной силы в ион-парной хроматографии приводит к снижению к' при разделении на обращенной фазе и к повышению к' при разделении на нормальной фазе. Влияние буферных ионов возрастает в последовательности: N02-<Br-<.CI-<S04²-. Селективность растворителя в ион-парной хроматографии изменяется по тем же правилам, как и в случае распределительной жидкостной хроматографии.

обращенно-фазная хроматография

От обычной обращенно-фазной хроматографии легко перейти к ион-парной на обращенной фазе, и наоборот.

Ион-парное разделение на обращенной фазе может быть проведено несколькими методами:

1)   на привитой к матрице неподвижной фазе, состоящей из углеводородов;

2)  то же самое, но в качестве противоиона используют ПАВ;

3)   на неподвижной фазе, состоящей из механически удерживаемой органической жидкости;

4) на неподвижной фазе, содержащей жидкий ионообменник.

Важным условием проведения ион-парной хроматографии является стабильность системы. Это означает в случае механически удерживаемой жидкости несмешиваемость водной и органической фаз, что достигается четким термо-статированием и предварительным насыщением подвижной фазы неподвижной. При работе с нормальной фазой при введении противоиона в неподвижную фазу необходимо предотвратить его унос неподвижной фазой за счет образования ионных пар, покидающих болонку. Противоион в этом случае добавляют в образец до введения его в хроматограф или в подвижную фазу. Поскольку в ион-парной хроматографии работают с полярными веществами, склонными к образованию хвостов, следует помнить, что в этом случае желательно применить другую подвижную или неподвижную фазу, другой противоион. Необходимо, чтобы в ион-парной хроматографии при изменении концен-трации не изменялось значение к' образца, что может повлечь образование хвостов. Водная фаза должна иметь постоянную концентрацию лротивоиона и рН. Обычно используют цитратный или фосфатовый буферный раствор. Иногда противоион сам является буфером. В случае разделения при низких рН растворы сильных кислот обеспечивают достаточное буферное действие.

Интересно проследить роль противоиона в ион-парной обращенно-фазной хроматографии. Можно написать следующие уравнения для образца, имеющего анион и катион:

k'=(Vs/Vm)E(c⁺), k'={Vs/Vm)E(c),

где Е—константа экстракции конкретной ион-парной системы; (с+) и (с-) — концентрации анионного и катионного противоиона.

При прочих неизменных условиях Е постоянна и, следовательно, повышение концентрации противоиона в подвижной фазе приводит к увеличению к' при разделении на обращенной фазе. В нормально-фазной ион-парной хроматографии к' также меняется за счет изменения концентрации противоиона в подвижной фазе. Значение к' может регулироваться типом противоиона, например, замена гептансульфокислоты пентансуль-фокислотой может изменить к' в 2—5 раз. Этот эффект ярко выражен при низких концентрациях противоиона. Крупные молекулы противоиона дают большие величины к' при ион-парном разделении на обычной фазе. Так, переход от тетра-этиламмония к тетрапентиламмонию позволил изменить к' на несколько порядков.

Ионная пара В+Р-

 

будет растворяться в полярной органической фазе, например в смеси спирта с хлороформом, а ионные формы будут растворяться в воде. Для определения ароматических сульфокислот применяют в качестве противоиона тетра-бутиламмоний, а для анализа хинина—сульфокислоты камфоры. В качестве противоиона обычно используют четвертичные или третичные амины, соли сульфокислот. Наиболее часто применяют тетраметил, тетрабутил, пальметилтриметиламмоний для анализа кислот, сульфированных красителей и третичные амины типа триоктиламина для анализа сульфонатов. Противоионами для анализа оснований являются соли алкил- и арилсульфокислот, перхлораты, пикраты.

Существует четыре варианта ион-парной хроматографии:

1)   адсорбционная хроматография, когда ионные пары вымываются элюентом с силикагеля;

2)   нормально-фазная распределительная хроматография, когда вода, нанесенная на пористую подложку, является неподвижной фазой, органический растворитель—элюентом;

3)   обращенно-фазная распределительная хроматография с органическим растворителем в качестве неподвижной фазы и водой в качестве элюента;

4)  обращенно-фазная хроматография, когда гидрофобный ион, образующий ионную пару, адсорбируется углеводородной частью неподвижной фазы. Иногда добавляют ПАВ, например цетилтриметиламмонийбромид (цетримид).

Ион-парную хроматографию применяют и для разделения амфотерных веществ. Когда ион-парную хроматографию применяют в нормально-фазном варианте в качестве противоионов, иногда используют ионы, способные к абсорбции света или к флуоресценции, для улучшения идентификации некоторых не поглощающих свет соединений. В этом варианте ион-парной хроматографии селективность системы изменяется за счет изменения полярности органической фазы. В табл. 3.4 приведены примеры использования ион-парной хроматографии при работе в режиме нормально-фазной хроматографии.

Однако наиболее часто применяют ион-парную хроматографию на обращенной фазе, при которой в качестве подвижной фазы используют водный буферный раствор и органический растворитель, смешивающийся с водой, обычно метанол или ацетонитрил. В подвижную фазу добавляют противоион, заряд которого противоположен заряду молекулы, а в качестве сорбента используют силикагель с химически привитой фазой, обычно Се или Ci8. Иногда разделение осуществляют с применением несмешиваемой с водой механически удерживаемой фазы, например, бутанола. При разделении на обращенной фазе более стабильной, чем механически удерживаемая фаза, водные образцы могут непосредственно вводиться в колонку, что особенно важно для анализа биологических образцов. При этом нет необходимости в предварительной очистке, так как гидрофильные компоненты мгновенно вызываются из колонки. Градиентное элюирование проводят, изменяя концентрацию противоиона в подвижной фазе или меняя полярность растворителя. При изменении концентрации противоиона, который остается в неподвижной фазе, изменяется сила растворителя, а при изменении рН подвижной фазы изменяется селективность разделения.

ИОН-ПАРНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ион-парная хроматография давно находила применение в жидкостной хроматографии и экстракции для извлечения лекарств и их метаболитов из биологических жидкостей в органическую фазу. Как самостоятельный раздел ВЭЖХ ион-парная хроматография, называвшаяся также экстракционной, парно-ионной, хрома­тографией с использованием ПАВ, хроматографией с жидким ионообменником, стала развиваться с середины 70-х годов. Метод занимает промежуточное положение между ионообменной хроматографией и адсорбционной, распределительной или обращенно-фазной. Недостатки ионообменных материалов, а именно невоспроизводимость от партии к партии, меньшая активность и стабильность по сравнению с другими сорбентами и небольшой выбор наполнительного материала, исключающий изменение селективности за счет сорбента, привел к некоторому ограничению применения ионооб­менной хроматографии. В ион-парной хроматографии большинство этих недостатков можно преодолеть. Метод ион-парной хроматографии характеризуется универсаль­ностью и обладает преимуществом по сравнению с классической ионообменной хроматографией, в котором активные центры фиксированы. Вследствие более быстрой массопередачи в ион-парной системе хроматографическое разделение более эффективно, чем на ионообменнике с фиксированными и активными зонами.

Ион-парную хроматографию используют для разделения образцов, содержащих как ионные, так и неионные соединения. Ее применяют в тех случаях, когда трудно или невозможно получить приемлемое разделение образца методом ионообменной хроматографии адсорбционной или обращенно-фазной. В некоторых случаях ионные соединения можно разделить на обращенной фазе, придавая им свойства неионных соединений (подавление ионов) с помощью буферного раствора с соответствующим рН, при котором равновесие смещается в сторону образования неионизированной формы. Полярные вещества, обладающие липофильными свойствами, делятся при этом на обращенной фазе как неполярные. Однако большинство наполнительных материалов колонок надежно работает только при рН=1,5—7,5. Исключение составляет партисил 5 ОДС, работающий при рН=1—8,5. В этом диапазоне рН сильные кислоты и основания ионизированы.

Попытки разделения сильных кислот и оснований методом подавления ионов оказываются неудачными из-за плохого удерживания веществ и асимметрии пиков. Соединения, остающиеся ионизированными в интервале рН=2—8, удовлетворительно разделяются методом ион-парной хроматографии, когда в подвижную фазу добавляют противоион, заряд которого противоположен заряду молекулы, и создается ион-парный комплекс, обладающий свойствами неполярного вещества. Если к ионному соединению, растворимому только в воде, добавить противоион, то образуется ионная пара, которая, обладая свойством растворяться в органической фазе, распределится между водным и органическим слоем. Возможна также адсорбция липофильной части противоиона в углеводородной фазе наполнительного материала. Очевидно, что катионы будут хорошо экстрагироваться анионами, и наоборот.

Получение производных после разделения в колонке

Реакция сводится к получению производных уже разделенных зон образца. Обычно требуется тщательный подбор аппаратуры и реагентов. Этот метод был применен Стайном и Муром для анализа аминокислот, не имеющих окраски. Амино­кислоты после выхода из колонки взаимодействуют с нингидрином, превращаясь в окрашенные соединения, способные поглощать свет на длине волны 570 нм и обнаруживаемые фотометром.

Имеются следующие отличия этого метода от метода получения производных до колонки:

1)   могут использоваться для одновременного обнаружения два детектора;

2) скорость реакции должна быть большой;

3) реактив не должен обнаруживаться детектором;

4)  использование элюента может мешать выбору реагентов из-за нерастворимости или возможной реакции;

5) обнаруживаемые вещества могут распадаться и разрушаться.

Требуется тщательное конструирование узлов оборудования, поскольку эффекты размывания зоны вне колонки могут быть значительными.  Продолжительность реакции должна быть не более 20 мин во избежание большого внеколоночного размывания. Другим ограничением почти для всех видов реакций является преобладание воды в окончательной смеси, и поэтому хроматографирование проводят лишь с водными подвижными фазами или с растворителями, смешивающимися с водой. Некоторые реагенты, приведенные в табл. 3.3, применимы и для получения производных до колонки.

Конструкция системы с получением производных после колонок должна обеспечить смешение вытекающей из колонки жидкости с реагентом и выдержку при некоторой температуре Т в течение такого-то времени t. Для обеспечения выдержки в период t на участке между колонкой и кюветой детектора возможны три подхода:

1)  применение короткого отрезка капиллярной трубки, позволяющей проводить реакцию за 10—30 с;

2)   использование короткой колонки, наполненной стеклянными шариками небольшого диаметра (выдержка до 3 мин);

3) использование сегментированного потока, что улучшает перемешивание и увеличивает продолжительность выдержки до 20 мин.

Следует также учесть, что реагенты и подвижная фаза должны быть смешиваемы, что размывание зон вне колонки увеличивается при использовании более вязких реакционных смесей и при увеличении времени реакции. Для предотвращений этих явле­ний часто предпочитают проводить реакцию при повышенных температурах.

При протекании быстрых реакций в несегментированном потоке в коротких трубках основное — это смешение реакционной смеси до ее поступления в кювету детектора. Для смешения применяют специально сконструированные тройники, на выходе которых устанавливают свернутую в спираль трубку («смесительная спираль»). Обычно применяют тефлоновые спирали с внутренним диаметром от 0,2 до 0,5 мм и длиной 10 м. Некоторые производные могут быть получены и без добавления реагента, непосредственно в хроматографе за счет фотохимической реакции.

Получение производных до введения вещества в колонку

Производные до введения вещества в колонку получать легче. Реакцию и очистку вещества обычно проводят вне хроматографа. Этот процесс может быть медленным, одноэтапным и многоэтапным, причем нет никаких ограничений при проведении реакций. Применяют любой растворитель или смесь растворителей, продолжительность реакции не ограничена. Реагент берут в избытке и удаляют перед введением в хроматограф, причем возможен широкий выбор реагентов.

Производные можно получать для многих классов органических соединений, если предварительно проводить химическое превращение интересующих нас веществ в соединения, способные давать производные. Например, гидролиз сложных эфиров приводит к получению кислот и спиртов. Уменьшение полярности производных по сравнению с таковой в исходном образце приводит к двум важным следствиям: менее полярные вещества регистрируются в виде более острых пиков с большим числом теоретических тарелок, у них уменьшается разброс значений к' и появляется возможность разделения в изократическом режиме вместо градиентного. У полученных производных выше значения а для выбранных пар веществ. Описаны производные, чувствительность определения которых на электрохимическом детекторе очень высока. Некоторые реагенты, применяемые для получения производных, приведены в табл. 3.2.

Получение производных до колонки имеет следующие недостатки. Некоторые образцы дают более одного продукта реакции для одного конкретного вещества и, следовательно, два или больше пиков на хроматограмме для индивидуального вещества. Реакция не всегда протекает полностью или доопределенного предела для каждого анализируемого образца. Наконец, управление ходом реакции вручную может оказаться трудоемким и связанным с большой потерей времени, чего не наблюдается при автоматическом режиме получения производных после колонки.

Некоторые фирмы выпускают специальное оборудование для получения производных в автоматизированном режиме, на котором можно проводить операции растворения, экстракции, обработки реагентами, повторной экстракции, фильтрации, выпаривания с растворением осадка другим растворителем и т.д.

ВЭЖХ С ПОЛУЧЕНИЕМ ПРОИЗВОДНЫХ ДО И ПОСЛЕ КОЛОНОЧНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ

Использование не самого образца, а его производных в жидкостной хроматографии позволяет увеличить чувствительность и селективность метода. Иногда для получения производных необходимо предварительное концентрирование образца. Для многокомпонентных смесей обычно требуется предварительное разделение на более простые по составу фракции, чтобы исключить перекрытие зон в конечной хроматограмме или удалить примеси, влияющие на характеристики колонки. Некоторые соединения не обладают способностью поглощать свет, и для их определения с помощью высокочувствительных фотометрического или флуориметрического детекторов необходимо получить производные, регистрируемые этими детекторами. Присоединяя способную к флуоресценции группу к окси- или аминогруппе образца, можно обнаружить очень малые концентрации флуоресцирующих веществ.

Производные, полученные из экстрактов биоматериалов, имеют значительно меньшую полярность компонентов, что позволяет существенно изменить время их выхода и отделить от общей массы полярных соединений. Большинство реактивов, применяемых для модификации, реагирует с полярными группами образца, уменьшая его полярность. Уменьшение полярности полученных производных дает возможность применять адсорбционную хроматографию, а не обращенно-фазную, и легко отделить вещество от не вступивших в реакцию соединений. Полученные менее полярные производные экстрагируют и вводят в хроматограф. Таким образом очищают сложные загрязненные образцы фармацевтических или сельскохозяйственных препаратов, а также биохимические субстраты: мочу, плазму, сыворотку, кровь.

Чтобы разработать хороший способ модификаций, необходимо знать химическую структуру образца. Производные подбираются так, чтобы добиться хорошего отклика флуоресцентного или фотометрического детектора. Обработанный образец вводят в хроматограф для получения конечного разделения. Производные получают в тех случаях, когда необходимо:

1) отделение от матрицы интересующего нас соединения;

2)  улучшение разделения за счет снижения полярности или изменение значений а выбранных пар компонентов;

3) повышение отклика детектора на конкретные компоненты образца;

4)  изменение отклика детектора на различные компоненты образца, в результате чего могут количественно оцениваться интересующие нас вещества даже при наличии перекрывающихся зон не интересующих нас соединений. Две последние причины наиболее актуальны. Производные получают и в случае нестойких веществ, которые могли бы разложиться в хроматографе. Так обрабатывают арилгидроксиламины метилизоцианатом, переводя их в карбамиды.

Общие аспекты получения производных в жидкостной хроматографии в целях повышения чувствительности подробно рассмотрены в литературе. Производные могут быть получены до введения вещества в колонку и после разделения его на хроматографической колонке перед прохождением детектора.

установление пригодности растворителей

Единственным путем установления пригодности растворителей для ГВЭЖХ служит проверка в реальных хроматографических условиях с градиентом требуемого состава, но без введения пробы вещества (холостой градиент). Как правило, проверку проводят сначала на более грубых шкалах детектора и при длинах волн 254 или 280 нм, а при получении положительного результата переходят на более чувствительные шкалы и длины волн 220 нм и ниже. Если работа по ГВЭЖХ прервана на относительно большой срок (более недели) или один из растворителей (или оба) заменены на новые (даже той же квалификации и партии), всегда следует до начала работы с образцами создать холостой градиент для проверки работоспособности системы в целом.

Следует отметить, что многие добавки к растворителям, такие, как соли, кислоты, ион-парные и другие реагенты, способны заметно изменить свойства растворителей. Так, накопление полифосфатов в солях фосфорной кислоты, используемых для приготовления буферных растворов, приводит к существенному дрейфу при градиенте из-за сильного УФ-поглощения полифосфатов. В некоторых случаях удается уменьшить дрейф в градиентном режиме, если уравнять УФ-поглощение слабого и сильного

элюирующих растворов добавкой УФ-поглотителя, такого, как ацетон, к менее УФ-поглощающему раствору. Градиент тем легче осуществить, чем он меньше по диапазону, поэтому целесообразно менять растворитель по составу только в тех пределах, которые необходимы для разделения. Это позволяет повысить чувствительность, уменьшить дрейф нулевой линии и количество ложных пиков, а также ускорить как элюирование, так и возврат системы к исходным условиям для нового анализа.

Если при градиентном элюировании используют другой тип детектора, например флюориметрический, высокие требования к чистоте растворителей остаются, но меняется их направленность — не должно быть флюоресцирующих примесей. О пригод­ности растворителей для работы судят также, осуществляя холостой градиент.

В заключение отметим, что к градиентному элюированию следует прибегать только в тех случаях, когда его применение является единственным путем решения данной проблемы. Если проверка в градиентном режиме показала, что возможно использовать изократический вариант для интересующих .веществ, следует немедленно перейти к нему. Это всегда выгодно, даже в тех случаях, когда анализ разбивается на два изократичеоких, выполняемых на двух приборах с более сильным и более слабым растворителями. Более воспроизводимые результаты и возможность использовать более чувствительные шкалы, менее жесткие требования к качеству растворителя — это только некоторые из получаемых преимуществ.

Следует также отметить, что при работе в обращенно-фазном режиме с системой метанол — вода, вязкость которой не аддитивна, а меняется от 1 до 1,5 и затем до 0,6 Мпа*с при переходе от 100% воды к 100% метанола, колонка находится в неблагоприятных условиях, так как при постоянном расходе давление на колонку сначала возрастает в 1,5 раза, а затем падает в 2 раза к концу градиентного элюирования. Картина повторяется в процессе регенерации колонки, при возврате к слабому растворителю. Это сокращает срок службы колонки и затрудняет работу с колонками, содержащими мелкий сорбент (менее 5 мкм).

в случае обращенно-фазной ГВЭЖХ

 

Наконец, очень важно правильно выбрать растворитель и добавки для него при ГВЭЖХ. Если при изократической ВЭЖХ небольшие примеси, присутствующие в растворителе, приходят в равновесие с сорбентом и обычно не дают ложных пиков или увеличения шумов, то в ГВЭЖХ требования к чистоте растворителей значительно более жесткие. Например, в случае обращенно-фазной ГВЭЖХ использование воды, недостаточно очищенной от органических загрязнителей, присутствующих в природной воде или привнесенных в процессе ионообменной очистки или перегонки, приводит к появлению набора интенсивных пиков, элюируемых из колонки метанольно-водным или ацетонитрильно-водным градиентом. Перегонка воды часто приводит (если аппаратура выбрана неудачно) не к уменьшению, а к увеличению количества и содержания органических загрязнителей, добавляющихся при контакте воды с недостаточно чистой аппаратурой, полимерными пробками и шлангами, смазками на органической основе и т.д. Кроме того, многие органические вещества, малолетучие сами по себе, способны легко перегоняться с водяным паром и, следовательно, загрязнять конденсат. Наиболее надежным методом очистки воды для ГВЭЖХ следует признать двукратную дистилляцию в стеклянной или кварцевой аппаратуре на шлифах, при этом на первой стадии проводится окисление примесей перманганатом калия, а на второй — обработка щелочью для удаления кислых веществ. Если после этого необходима дополнительная очистка, ее проводят пропусканием воды через колонку большого диаметра с крупным (30—100 мкм) обращенно-фазным сорбентом, используемым для препаративной работы и относительно дешевым. Хранить такую высокочистую воду желательно в темном месте в бутыли, тщательно закрытой пробкой. Вода не должна контактировать с полимерами, выделяющими в нее продукты деструкции, стабилизаторы, пластификаторы и другие загрязнители. Желательно не хранить высокочистую воду длительный срок, так как ее чистота сохраняется относительно недолго.

Другие растворители для ГВЭЖХ должны быть квалификации «для УФ-спектроскопии» или «для жидкостной хроматографии». Производство ацетонитрила и метанола, а также воды таких квалификаций освоено нашей промышленностью. При хранении, а также использовании таких растворителей всегда следует помнить о потенциальных загрязнителях и по мере возможности избегать их.

Примеси, находящиеся в метаноле или ацетонитриле, точно так же могут накапливаться на колонке и проявляться в виде пиков при градиенте. Это легко понять, если представить себе, что начальный состав растворителя органический компонент — вода 50 : 50. Невымываемая таким растворителем примесь, например нафталин, может быть добавлена как в воду, так и в метанол и будет накапливаться в начале колонки одинаково независимо от компонента системы растворителей, ее содержащего (метанола или воды). Если спустя какое-то время начать градиентное элюирование, наф­талин при более сильном растворителе начнет двигаться и выйдет в виде узкого пика.

Наиболее жесткие требования предъявляют к растворителю если градиент осуществляется с детектированием при длинах волн ниже 220 или 210 нм, так как в этом случае поглощают и проявляются в виде пиков многие примеси, УФ-прозрачные при 254 или 280 нм.