Реакция сводится к получению производных уже разделенных зон образца. Обычно требуется тщательный подбор аппаратуры и реагентов. Этот метод был применен Стайном и Муром для анализа аминокислот, не имеющих окраски. Аминокислоты после выхода из колонки взаимодействуют с нингидрином, превращаясь в окрашенные соединения, способные поглощать свет на длине волны 570 нм и обнаруживаемые фотометром.
Имеются следующие отличия этого метода от метода получения производных до колонки:
1) могут использоваться для одновременного обнаружения два детектора;
2) скорость реакции должна быть большой;
3) реактив не должен обнаруживаться детектором;
4) использование элюента может мешать выбору реагентов из-за нерастворимости или возможной реакции;
5) обнаруживаемые вещества могут распадаться и разрушаться.
Требуется тщательное конструирование узлов оборудования, поскольку эффекты размывания зоны вне колонки могут быть значительными. Продолжительность реакции должна быть не более 20 мин во избежание большого внеколоночного размывания. Другим ограничением почти для всех видов реакций является преобладание воды в окончательной смеси, и поэтому хроматографирование проводят лишь с водными подвижными фазами или с растворителями, смешивающимися с водой. Некоторые реагенты, приведенные в табл. 3.3, применимы и для получения производных до колонки.
Конструкция системы с получением производных после колонок должна обеспечить смешение вытекающей из колонки жидкости с реагентом и выдержку при некоторой температуре Т в течение такого-то времени t. Для обеспечения выдержки в период t на участке между колонкой и кюветой детектора возможны три подхода:
1) применение короткого отрезка капиллярной трубки, позволяющей проводить реакцию за 10—30 с;
2) использование короткой колонки, наполненной стеклянными шариками небольшого диаметра (выдержка до 3 мин);
3) использование сегментированного потока, что улучшает перемешивание и увеличивает продолжительность выдержки до 20 мин.
Следует также учесть, что реагенты и подвижная фаза должны быть смешиваемы, что размывание зон вне колонки увеличивается при использовании более вязких реакционных смесей и при увеличении времени реакции. Для предотвращений этих явлений часто предпочитают проводить реакцию при повышенных температурах.
При протекании быстрых реакций в несегментированном потоке в коротких трубках основное — это смешение реакционной смеси до ее поступления в кювету детектора. Для смешения применяют специально сконструированные тройники, на выходе которых устанавливают свернутую в спираль трубку («смесительная спираль»). Обычно применяют тефлоновые спирали с внутренним диаметром от 0,2 до 0,5 мм и длиной 10 м. Некоторые производные могут быть получены и без добавления реагента, непосредственно в хроматографе за счет фотохимической реакции.
