Обычно эксклюзионное разделение проводили при 20-25°С, часто без термостатирования. Некоторые труднорастворимые полимеры (полиэтилен, полипропилен, полиамиды и др.) анализируют при 135-150°С. Повышение температуры широко применяют для снижения вязкости растворителей, так как при этом увеличиваются коэффициенты диффузии и, следовательно, эффективность колонок. В связи с тем, что этот эффект сильнее проявляется для самых высокомолекулярных фракций, даже небольшое повышение температуры анализа позволяет улучшить разделение именно в той области, где оно наименее эффективно. Поэтому целесообразно работать при повышенных температурах (40-50°С вместо комнатной температуры) и в тех случаях, когда подвижная фаза имеет низкую вязкость. Некоторые полужесткие гели для эксклюзионной хроматографии в водных средах (например, ОН-пак и ион-пак) рекомендуется использовать при 40-80°С, так как в этих условиях они имеют максимальную разрешающую способность.
Термостатирование колонок (±0,5°С) существенно повышает точность результатов.
Гидродинамические объемы макромолекул полистирола, а следовательно, и их удерживаемые объемы зависят от растворителя и температуры. Показано [41], что они увеличиваются на 10% при изменении температуры от 25 до 35°С в толуоле и от 45 до 35°С
— в хлороформе. Определены температурные интервалы, в которых данными изменениями можно пренебречь: 25-50°С для тетрагидрофурана, 20-30°С и 45-55°С — для хлороформа и 35-65 °С — для толуола. Эти интервалы рекоамендованы авторами для практической работы.
Размер и вязкость пробы. Эксклюзионные колонки очень чувствительны к перегрузке пробой. Максимальная масса полимера, которую можно вводить в колонку, составляет 0,1-0,5мг на 1 г сорбента. При работе с наиболее часто применяемыми колонками диаметром 7-8мм и длиной 50-60см масса образца, как правило, не должна превышать 3-5мг.
При большей нагрузке возрастают объемы удерживания и падает эффективность колонки. Образцы всегда желательно растворять в растворителе, который в данный момент используют в качестве подвижной фазы. Концентрация полимера в растворе должна быть достаточно низкой, чтобы уменьшить вязкость пробы и избежать проявления межмолекулярных взаимодействий полимера в растворе. Допустимые значения концентрации полимеров в зависимости от их молекулярной массы при разделении на колонках с (i-стирогелем, рекомендуемые фирмой «Уотерс», должны быть следующие:
Молекулярные
массы..... <20000 30000—200000 400000—2000000 >2000000
Концентрация, % (масс). . . . 0,25 0,1 0,05 0,01
Соблюдение указанных концентраций особенно важно для анализа полимеров с узким ММР, в частности, для калибровочных стандартов. Увеличение вязкости анализируемого раствора приводит к резкому ухудшению разделения и занижению найденных молекулярных характеристик полимера. Принято считать, что вязкость пробы может превышать вязкость подвижной фазы максимум в два раза [20].
При анализе низкомолекулярных веществ (Л//<3000) и полимеров с широким диапазоном ММР можно использовать более высокие концентрации.
Типичные значения объема пробы в эксклюзионной хроматографии лежат в пределах 25-300 мкл. Естественно, что при большей дозе возрастает размывание полосы. Как правило, объем пробы должен быть менее 1/3 объема, занимаемого в колонке индивидуальным низкомолекулярным соединением, элюирующимся из колонки в зоне полного проникания. Этот объем легко определить по ширине его пика у основания. Однако если чувствительность детектора недостаточна и приходится увеличивать массу образца, то нужно увеличивать объем пробы, а не концентрацию, так как в этом варианте ухудшение характеристик колонки будет заметно меньше.
Для получения надежных и воспроизводимых результатов определения ММР концентрационные эффекты должны быть устранены в максимально возможной степени. Поэтому в каждом отдельном случае нужно экспериментально определять допустимую массу образца, концентрацию и объем дозируемого раствора полимера, при которых еще не искажаются характеристики удерживания, выбрать оптимальные значения и выдерживать их во всех анализах.
